使用腺病毒過表達(dá)TXNIP對(duì)H9C2心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響.pdf

1、研究背景：
　　近年來，全球糖尿病的發(fā)病率、死亡率明顯上升，已成為威脅人類健康與壽命的最重要疾病之一。糖尿?。―iabetesMellitus）是由遺傳和環(huán)境等因素引起胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，導(dǎo)致糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝異常，而以慢性高血糖為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征。除引起糖脂代謝的紊亂外，糖尿病可引起心、腎、腦等多個(gè)器官的合并癥，其中以心臟并發(fā)癥最為危險(xiǎn)，是導(dǎo)致糖尿病人死亡的最主要原因。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示，無(wú)論是高糖高

2、脂喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素注射造成的慢性2型糖尿病大鼠模型，還是高糖高脂刺激的培養(yǎng)心肌細(xì)胞，均觀察到明顯的心肌細(xì)胞損傷和凋亡，其機(jī)制與高糖高脂刺激引起硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)的活性下降有關(guān)，而硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteractingprotein,TXNIP)的表達(dá)明顯上調(diào)，是糖尿病引起Trx功能下降的重要原因。
　　TXNIP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種內(nèi)源性的Trx結(jié)合抑制蛋白，在腫瘤、糖尿病

3、等疾病中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)室之前在高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素注射制備的2型糖尿病模型和高糖高脂刺激的培養(yǎng)成鼠心肌細(xì)胞上都發(fā)現(xiàn)了TXNIP表達(dá)的顯著增加，而且是糖尿病時(shí)Trx系統(tǒng)相關(guān)各蛋白中變化最明顯的一個(gè)，同時(shí)觀察到糖尿病或高糖高脂刺激引起了心肌細(xì)胞的損傷和凋亡。但是TXNIP的上調(diào)僅僅是糖尿病時(shí)一種繼發(fā)的伴隨性變化，還是本身參與了糖尿病細(xì)胞損傷的發(fā)生，尚不清楚。為分析此問題，我們前期構(gòu)建了TXNIP的干擾質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的H9C2細(xì)

4、胞，觀察抑制高糖高脂引起的TXNIP表達(dá)，是否可以減輕心肌細(xì)胞的損傷和凋亡。結(jié)果表明，使用RNA干擾技術(shù)減弱TXNIP的上調(diào)后，高糖高脂刺激引起的心肌細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡減輕，Trx的活性顯著提高，可以證明TXNIP的上調(diào)是糖尿病引起心肌細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)。
　　考慮到前述研究均是在糖尿病或模擬條件下的觀察，研究TXNIP的作用時(shí)仍不能排除高糖高脂的直接或TXNIP以外的損傷途徑，因此，為進(jìn)一步明確TXNIP的表達(dá)升高本身是否足以引

5、起心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，采用腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞，使心肌細(xì)胞過表達(dá)TXNIP，觀察單純TXNIP增多對(duì)正常糖脂培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響，并對(duì)其損傷機(jī)制進(jìn)行了簡(jiǎn)要分析。
　　目的：
　　運(yùn)用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使心肌細(xì)胞過表達(dá)TXNIP，以觀察正常培養(yǎng)條件下細(xì)胞單純過表達(dá)TXNIP是否可以引起心肌細(xì)胞凋亡，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析，以明確TXNIP在糖尿病心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其途徑。
　　方法：

6、　　1.使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使心肌細(xì)胞過表達(dá)TXNIP
　　使用處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即：正常培養(yǎng)組、不含目的基因的腺病毒對(duì)照組（Ad-eGFP組）、TXNIP過表達(dá)（Ad-TXNIP-eGFP）組；在轉(zhuǎn)染前一天分別換液處理，第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，病毒滴度按每個(gè)細(xì)胞100個(gè)病毒顆粒計(jì)算。4h后補(bǔ)加含10％胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，24h后換液處理，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，中間觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　2.確定轉(zhuǎn)染

7、效率
　　利用熒光倒置顯微鏡拍攝同一個(gè)視野下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)算同一個(gè)視野下帶綠色熒光蛋白細(xì)胞占整個(gè)視野下所有細(xì)胞的百分比計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)使用Real-timePCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá)。
　　3.分析TXNIP在心肌細(xì)胞損傷和凋亡中的作用
　　通過前兩部分實(shí)驗(yàn)，確定轉(zhuǎn)染率相對(duì)最高的時(shí)間點(diǎn)，分別收集各組培養(yǎng)細(xì)胞核培養(yǎng)基，測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）和3-硝基酪氨酸含量、p

8、38激酶、caspase-3及Trx活性,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用westernblot方法分別測(cè)TXNIP和Trx蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染效率
　　1.1熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率
　　鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功，24h、48h、72h轉(zhuǎn)染效率分別為：9.94％±1.12％、68.50％±4.57％、88.86％±3.23％，其中轉(zhuǎn)染72h的轉(zhuǎn)染效率顯著高于轉(zhuǎn)染24h(P<0.01)和轉(zhuǎn)染48h(P<

9、0.01)，因此該部分實(shí)驗(yàn)我們選擇轉(zhuǎn)染72h的細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析（圖1）。
　　1.2Real-timePCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá)
　　與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組細(xì)胞TXNIP的mRNA無(wú)顯著性變化（mRNA0.99±0.13vs.1.08±0.26;P>0.05），TXNIP過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比：TXNIP的mRNA水平顯著升高（mRNA1.24±0.28vs.1.08±0

10、.26;P<0.05），說明構(gòu)建載體、病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、過表達(dá)目的基因成功（圖2A,2B）。
　　1.3WesternBlot方法測(cè)定轉(zhuǎn)染成功后TXNIP表達(dá)增高、Trx蛋白表達(dá)未見明顯改變
　　如圖3所示：Ad-eGFP組與正常對(duì)照相比TXNIP蛋白表達(dá)無(wú)顯著改變（0.98±0.06vs.1.03±0.14；P>0.05），而與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP的TXNIP過表達(dá)組TXNIP蛋白水平明顯升高

11、(1.21±0.09vs.1.03±0.14；P<0.01)，同時(shí)測(cè)定發(fā)現(xiàn)Trx蛋白表達(dá)沒有顯著性的變化(1.14±0.09vs.1.09±0.05；P>0.05)，說明TXNIP表達(dá)增高對(duì)Trx的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（見圖4）。
　　1.4Trx活性測(cè)定
　　如圖5所示：與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組細(xì)胞Trx活性無(wú)顯著性變化（0.14±0.03vs.0.13±0.01;P>0.01），與Ad-eGFP組相比，TXNIP

12、過表達(dá)組Trx活性明顯降低（0.02±0.05vs.0.13±0.01;P<0.01），提示TXNIP的過表達(dá)不會(huì)引起Trx的蛋白表達(dá)量的改變但是會(huì)明顯的抑制Trx的活性。
　　1.5乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化
　　如圖6所示：與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組LDH活性沒有顯著性的差異（1344.53±127.12U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P>0.05）；而與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP

13、-eGFP組LDH活性顯著升高(1528.20±117.80U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P<0.01)，提示TXNIP表達(dá)增高可引起心肌細(xì)胞損傷。
　　1.6MDA生成測(cè)定
　　MDA是常用的反映膜脂質(zhì)過氧化損傷程度的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組MDA含量無(wú)顯著差別（14.65±2.14μMvs.13.14±2.36μM；P>0.01）；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eG

14、FP組MDA生成顯著升高(17.92±0.91μMvs.13.14±2.36μM；P<0.01)（圖7），提示TXNIP過表達(dá)引起氧化應(yīng)激增加，自由基損傷加重。
　　1.73-硝基酪氨酸含量測(cè)定
　　3-硝基酪氨酸是蛋白質(zhì)被過氧化亞硝酸自由基（ONOO-）硝基化修飾的產(chǎn)物，常作為反映過氧化亞硝酸自由基生成量及蛋白硝基化水平的指標(biāo)。如圖8所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組3-硝基酪氨酸生成無(wú)顯著性變化（1.28±0.35

15、μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P>0.01）；與Ad-eGFP組相比，TXNIP過表達(dá)組3-硝基酪氨酸生成顯著增加（1.63±0.56μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P<0.01），提示TXNIP明顯的增加了過氧化亞硝酸自由基及其損傷的發(fā)生。
　　1.8caspase-3活性測(cè)定
　　caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要途徑，如圖9所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組caspase-

16、3活性無(wú)顯著性變化（0.29±0.22nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP組與Ad-eGFP組相比，caspase-3活性明顯增高（1.79±0.53nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P<0.05），提示TXNIP過表達(dá)引起明顯的心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。
　　1.9p38激酶活性
　　p38激酶是介導(dǎo)氧應(yīng)激損

17、傷、激活caspase依賴凋亡途徑的重要激酶。如圖10所示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組p38激酶活性無(wú)明顯改變（1.08±0.05vs.1.07±0.04；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP組與Ad-eGFP組相比，p38激酶活性顯著升高(1.26±0.06vs.1.07±0.04；P<0.05)。
　　1.10流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡
　　如圖11所示，正常培養(yǎng)組與不含TXNIP的Ad-eGFP組間細(xì)胞凋亡率無(wú)顯