黃芪甲苷對H2O2誘導大鼠H9c2心肌細胞系凋亡的保護作用及機制研究.pdf

1、細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,在各種心血管疾病的發(fā)病機制中起到重要的作用。許多研究表明,心肌梗死,心肌病和心肌肥厚的心肌組織中都有細胞凋亡的發(fā)生。因為心肌細胞的再生能力有限,因此心肌凋亡引起的細胞損失會導致心力衰竭。抑制心肌細胞凋亡可以防止心力衰竭的發(fā)生。
　　 活性氧(ROS)可以通過誘導細胞凋亡導致心肌損害。過氧化氫(H2O2)是ROS的主要來源,它可以穿過細胞膜,擾亂細胞的天然抗氧化防御系統(tǒng),并導致脂質過氧化和細胞DNA的損

2、傷。
　　 過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是酶性抗氧化物家族成員,它們在細胞內起到抗氧化作用;它們是細胞內的氧自由基清除劑;它們是細胞內的抗氧化防御系統(tǒng)的一部分。許多研究證實,抗氧化物酶的過表達可以防止活性氧引起的心肌損傷。
　　 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可被生長因子、氧化應激等因素通過PI3K依賴途徑激活。當受到各種因素刺激時,膜受體酪氨酸激酶可以激活PI3K,PI

3、3K則將PI(4,5)P2轉化為PI(3,4,5)P3,從而激活Akt?；罨腁kt可以調節(jié)細胞周期進程,并與細胞死亡、黏附、遷移、代謝和腫瘤發(fā)生有密切關系。在心臟中,活化的Akt具有抑制細胞凋亡和保護心肌細胞的作用。有證據表明,在用心肌缺血預處理保護心臟的缺血/再灌注損傷中,Akt發(fā)揮了重要作用。
　　 Akt可以調節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達水平,并通過磷酸化調節(jié)Bcl-2家族蛋白的活性,而Bcl-2家族蛋白可以直接參與調控細

4、胞凋亡。Bcl-2家族的一些成員如Bcl-2和Bcl-xL起到抑制細胞凋亡作用,而Bad,Bax等則誘導細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白可根據它們的相對含量和磷酸化狀態(tài)而形成同源和/或異源二聚體。有實驗表明,Akt可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,當Bcl-2過表達,Bcl-2可以結合促凋亡蛋白Bax,形成Bcl-2/Bax的異源二聚體,保護細胞防止細胞凋亡。而當Bax高表達,游離的Bax蛋白可以形成誘導死亡的同源二聚體,導致細胞凋亡。B

5、ad是一種促凋亡Bcl-2家族蛋白,它可以取代Bax與Bcl-2形成異源二聚體,使游離出來的Bax得以形成同源二聚體,誘導細胞凋亡。當Bad被磷酸化時,磷酸化的Bad無法再與Bcl-2結合,遂從Bcl-2異源二聚體中解離,顯示抗細胞凋亡的作用。研究顯示,無論在體外和體內,磷酸化的Akt可以使促凋亡蛋白Bad的136位絲氨酸磷酸化并通過抑制細胞凋亡起到保護心臟的作用。
　　 黃芪甲苷(ASI)作為一種天然的皂甙,被列在2005年版

6、中國藥典中,可以用來評估植物藥黃芪的質量。ASI已被證明具有多種生物及藥理活性,包括抗腫瘤,抗乙肝病毒,抗肝臟纖維化,防治糖尿病并發(fā)癥等作用。最近的研究顯示,ASI有明顯的保護心臟作用。但是,目前仍沒有關于ASI是否能夠保護心肌細胞氧化應激損傷的研究。
　　 目前尚不清楚ASI是否具有抑制活性氧誘導的心肌細胞凋亡的作用,本研究的目的是探討ASI是否能抑制H2O2誘導H9c2細胞凋亡及其可能的機制。
　　 材料與方法：

7、r>　　 1、細胞培養(yǎng):H9c2細胞(大鼠心肌細胞系),在DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。加入10％胎牛血清和抗生素在37℃,5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2、分組和干預:本研究共分7組,(1)對照組(C組);(2)H2O2組,細胞暴露于100μM的H2O224小時;(3)、(4)、(5)黃芪甲苷組,黃芪甲苷分別以三種不同的濃度(1,10,20μg/ml)預處理24小時,然后暴露在100μM的H2O224小時;(6)、(7)組

8、分別將PI3K的特異性抑制劑wortmannin(50 nM)和LY294002(15μM)分別加入到20μg/ml的黃芪甲苷組培養(yǎng)基中。
　　 3、采用MTT法檢測黃芪甲苷及H2O2對H9c2細胞存活力的影響,在490 nm測定吸光度,無細胞的孔作為空白對照。
　　 4、采用相應的試劑盒來分別檢測LDH,MDA,T-AOC,T-SOD,Gpx,CAT的活性。
　　 5、采用激光共聚焦法檢測細胞內活性氧的濃度。<

9、br>　　 6、采用Annexin V-FITC/PI法及Hoechst33258染色法來檢測細胞的凋亡。
　　 7、采用免疫印跡法檢測Akt,P-Akt(絲氨酸-473),Bad,P-Bad(絲氨酸-136),Bax,Bcl-2蛋白的表達。
　　 8、采用半定量實時RT-PCR法檢測Akt,Bad,Bax,Bcl-2 mRNA的表達。
　　 9、所有計量資料均用平均值(mean)±標準差(S.D.)表示。用統(tǒng)

10、計學軟件SPSS11.5進行數(shù)據分析,P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、不同濃度的ASI(1、10、20μg/ml)對H9c2細胞可促進細胞存活,呈劑量依賴關系。
　　 2、不同濃度的H2O2(10、50、100、200、400μM)對H9c2作用24小時細胞存活率呈劑量依賴性降低。用100μM的H2O2作用不同時間(12、24、36、48、60小時)導致H9c2細胞存活率呈時間依賴性降低。

11、
　　 3、不同濃度ASI(1、10、20μg/ml)預處理可以減輕H2O2誘導的H9c2細胞損傷,隨著ASI濃度的增加,相應的MTT法檢測的OD值也隨之增加。
　　 4、在H2O2作用后心肌細胞受到損傷,LDH和MDA的濃度均較C組明顯增高,抗氧化酶活性較C組明顯降低,細胞總抗氧化性明顯下降。ASI(1,10,20μg/ml)預處理培養(yǎng)細胞,在H2O2損傷過程中,均較H2O2組細胞損傷減小,LDH和MDA濃度明顯減少,

12、而抗氧化酶活性和細胞總抗氧化性較H2O2組明顯增加。
　　 5、經H2O2處理24小時后,細胞內熒光強度明顯增強,不同的濃度ASI(1、10、20μg/ml)預處理24小時后,與H2O2組相比細胞內熒光強度明顯下降并呈濃度依賴性。
　　 6、在熒光顯微鏡下,對照組細胞的細胞核呈圓形或橢圓形,染色均勻并呈現(xiàn)藍色淡染,H2O2組見細胞核大量致密濃染、顏色白亮的凋亡細胞。經不同濃度ASI處理后,致密濃染、顏色白亮的細胞核逐漸減

13、少,并呈劑量相關性。
　　 7、采用Annexin FITC/PI法檢測心肌細胞凋亡率的結果顯示:H2O2組心肌細胞凋亡率明顯高于C組;與H2O2組比較,ASI(1、10、20μg/ml)組細胞凋亡率明顯降低,且隨著ASI劑量的增加,凋亡率逐漸下降。
　　 8、Western blotting結果顯示:H2O2作用24小時后,Akt在各組中都有表達,差異無統(tǒng)計學意義,p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達量較C組明顯

14、減少,Bax蛋白表達量較C組明顯增加,差異具有顯著性。ASI(1、10、20μg/ml)呈劑量依賴性增加p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達,降低Bax蛋白的表達,差異有顯著性。Wortmannin和LY294002預處理可以拮抗ASI的部分保護作用。
　　 9、Real-time RT-PCR結果顯示:H2O2作用24小時后,Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達均較C組明顯減少,Bax mRNA表達則較C組明顯增加；

15、ASI(1、10、20μg/ml)呈劑量依賴性增加Akt,Bad,Bcl-2 mRNA的表達,降低Bax mRNA的表達,與H2O2組比較差異有顯著性。LY294002和wortmannin預處理可以拮抗ASI的部分保護作用。
　　 結論：
　　 1、ASI對H9c2細胞存活率的影響具有時間和劑量依賴性。
　　 2、ASI通過降低MDA,增加抗氧化物酶活性,提高總抗氧化能力來減輕H2O2誘導的細胞損傷。