2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、一、目的:
   近年來,國內(nèi)外大量研究文獻(xiàn)都表明氧化應(yīng)激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機(jī)制,在許多心血管疾病的病理過程中都有過量氧自由基產(chǎn)生,同時抗氧自由基防御機(jī)制卻受到抑制,如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓病、缺血性心臟病、高脂血癥等。氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸與氧化應(yīng)激的程度相關(guān),在一定應(yīng)激強(qiáng)度范圍內(nèi),氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞造成的損傷是可逆的,而超過一定限度,則對心肌細(xì)胞造成不可逆的損傷,主要包括心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。

2、>   原癌基因Pim(Proviral integration site of murine)家族是哺乳動物細(xì)胞中的絲/蘇氨酸激酶,屬于鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶,包括Pim-1、Pim-2和Pim-3。大量的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí),Pim激酶的上調(diào)與細(xì)胞凋亡的抑制存在顯著的相關(guān)性。Pim-2持續(xù)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞長期抵抗各種凋亡信號的刺激。研究證實(shí)Pim-1在Akt通路中保護(hù)心肌細(xì)胞損傷,而在Pim-1缺失小鼠中Pim-2的表達(dá)增高了4.6倍

3、;Pim-1缺失小鼠在心梗后7天,Pim-2的表達(dá)增高2.75倍。但Pim-2在心肌細(xì)胞中的表達(dá)及作用尚缺乏研究,有必要探討Pim-2在心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。
   三七是具有多種心血管活性的中藥,臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治?,F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷(Panax notoginseng saponin,PNS)是三七的主要活性成分,含有多種單體皂苷主要有:人參皂苷Rb1,人參皂苷Rg1,三七皂苷R1。本課題以

4、三七皂苷R1為研究對象,旨在了解三七皂苷R1對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并探討其參與調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號通路,凋亡相關(guān)蛋白,并了解其對Pim-2的調(diào)控作用。
   二、方法:
   1.乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)外科無菌條件下取出乳鼠心臟,用胰酶4℃過夜,終止消化,再用膠原酶消化液逐步消化法分離單個心肌細(xì)胞,接種至培養(yǎng)瓶中,采取差速貼壁分離法以去除心肌成纖維細(xì)胞,得到純度較高的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
   2.H2O2致心肌細(xì)胞

5、氧化應(yīng)激模型建立心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)2-3天后,選取細(xì)胞密度在80%-95%以上的,自律性搏動120~140次/min的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),選取不同濃度與時間點(diǎn)的H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞,選擇合適的濃度及干預(yù)時間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
   3.三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞培養(yǎng)的第2-3天,細(xì)胞生長接近80%融合時,心肌細(xì)胞預(yù)先用不同濃度三七皂苷R1培養(yǎng)24h,進(jìn)行三七皂苷R1毒性測試,選取合適的高、中、低劑量組進(jìn)行相關(guān)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
 

6、  4.MTT比色法測定心肌細(xì)胞活力將心肌細(xì)胞接種于九十六孔板,按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后,按MTT法具體操作步驟進(jìn)行操作,在酶標(biāo)儀490nm處測其OD值并計算各組心肌細(xì)胞存活率。
   5.流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率心肌細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組處理后,用不含EDTA的胰酶消化收集,以Annexin V-FITC/Propidium Iodide進(jìn)行染色,室溫、避光、反應(yīng)5~15min,上流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長

7、530nm)進(jìn)行檢測。
   6.心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD的檢測將心肌細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中,按不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組處理,處理完畢后,分別按照LDH、MDA、SOD檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,在酶標(biāo)儀420nm處測量每組OD值并計算各組細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA、SOD的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。
   7.實(shí)時定量PCR檢測心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)心肌細(xì)胞按照2×107/孔的濃度接種至六孔板中,取正常培養(yǎng)2-3

8、天后狀態(tài)最佳的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組依次為:正常對照組、H2O20.5、1、2、3、6h五個時間組,50μMH2O2干預(yù)心肌細(xì)胞。用Trizol提取心肌細(xì)胞總RNA,在紫外分光光度計上測定OD260/OD280,鑒定提取的RNA純度和濃度。然后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)Gene Bank中Pim-2、GAPDH的基因序列資料,借助于計算機(jī)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計引物,上機(jī)進(jìn)行目的基因的熒光定量檢測。
   8

9、.SiRNA沉默心肌細(xì)胞Pim-2基因調(diào)合適的細(xì)胞濃度分別接種于六孔板或九十六孔板中,正常培養(yǎng)2-3天左右,當(dāng)貼璧細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合時,取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。siPORTTM NeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑與DMEM培養(yǎng)基混勻室溫孵育15min, siRNA稀釋液等體積混勻,孵育15min。然后將混合液加入培養(yǎng)板混勻。轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48~72h后收集細(xì)胞,再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率。
  

10、 9.Western blot法檢測心肌細(xì)胞蛋白的表達(dá)心肌細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組處理完成后,以Western及IP細(xì)胞裂解液提取心肌細(xì)胞蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。以Actin為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,孵育一抗和二抗,ECL顯色,KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析

11、條帶灰度值以檢測目的蛋白的表達(dá)水平。
   10.統(tǒng)計分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若符合正態(tài)分布和方差齊性,則采用方差分析。若不符合正態(tài)分布和方差齊性,則采用秩和檢驗(yàn)。方差齊性時兩兩比較采用LSD法,方差不齊時兩兩比較采用Tamhane's T2法。多組計數(shù)資料的比較(各組AV評分)采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法。

12、各實(shí)驗(yàn)組不同缺血及再灌注時間點(diǎn)血流動力學(xué)指標(biāo)采用重復(fù)測量方差分析。檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)α=0.05。
   三、結(jié)果:
   1.三七皂苷R1對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用
   1.1 H2O2對心肌細(xì)胞損傷的濃度效應(yīng)關(guān)系MTT比色法檢測不同濃度H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞3h后,細(xì)胞活力顯著降低,光鏡下可看到細(xì)胞搏動減弱甚至停止,細(xì)胞密集區(qū)域出現(xiàn)大片細(xì)胞脫落。與正常對照組比較,H2O2干預(yù)的各組細(xì)胞活力均有所下降,經(jīng)統(tǒng)

13、計分析各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=734.372,P<0.001),且隨著H2O2濃度的增加各組細(xì)胞活力出現(xiàn)遞減趨勢。
   1.2不同濃度三七皂苷R1對心肌細(xì)胞活力的影響不同濃度三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞24h,比較各濃度三七皂苷R1作用后細(xì)胞活力與正常對照組的差異。經(jīng)統(tǒng)計分析,三七皂苷R1濃度為0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L時細(xì)胞活力與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.0

14、5),而濃度為50×10-6mol/L、100×10-6mol/L時,作用心肌細(xì)胞24h后細(xì)胞活力較正常對照組顯著降低(P<0.001)。
   1.3三七皂苷R1預(yù)處理對H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞活力的影響三七皂苷R1低、中、高濃度(0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L)預(yù)處理心肌細(xì)胞24h,然后以H2O2(50μmol/L)作用細(xì)胞3h,同時設(shè)立正常對照組、模型組,比較各不同濃度三七皂苷R

15、1對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力的影響。經(jīng)統(tǒng)計分析表明,各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義((F=519.758,P<0.001)。三七皂苷R1預(yù)處理后可呈濃度依賴性減輕H2O2處理后心肌細(xì)胞活力的下降。
   1.4三七皂苷R1預(yù)處理對H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率,比較各不同濃度三七皂苷R1對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響。經(jīng)三七皂苷R1預(yù)處理后,各組細(xì)胞凋亡與模型組相比有所減少,尤其是高濃

16、度組的凋亡情況顯著改善。經(jīng)統(tǒng)計分析,各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。
   1.5三七皂苷R1預(yù)處理對H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD的影響試劑盒檢測各組心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD值,結(jié)果與正常對照組比較,模型組心肌細(xì)胞SOD活性顯著降低,而LDH活性、MDA含量則顯著增加(P<0.001);三七皂苷R1可呈劑量依賴性增加SOD活性,降低LDH活性、MDA含量,各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

17、01)。
   2三七皂苷R1對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號通路、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
   2.1三七皂苷R1預(yù)處理對H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞MAPK信號通路的影響
   2.1.1 Western Blot檢測各組細(xì)胞中P-ERK1/2、總ERK1/2蛋白表達(dá)的變化,分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比,模型組(H2O2) P-ERK1/2表達(dá)顯著提高,三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-

18、ERK1/2表達(dá)顯著降低,其中高劑量組表達(dá)降低最為顯著。各組間P-ERK1/2表達(dá)存在顯著差異(P<0.01)。
   2.1.2 Western Blot檢測各組細(xì)胞中P-JNK、總JNK蛋白表達(dá)的變化,分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比,模型組(H2O2) P-JNK表達(dá)顯著提高(P<0.001),三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。
   2.1.3 Western

19、Blot檢測各組細(xì)胞中P-P38、總P38蛋白表達(dá)的變化,分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比,模型組(H2O2) P-P38表達(dá)顯著提高(P<0.001),三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-P38表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   2.2三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)的變化用WesternBlot檢測各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化,分析目的條帶的光密度值(IOD)

20、,正常組Bax、Bcl-2有一定量的表達(dá),與正常組相比,模型組Bax表達(dá)顯著增高,三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸降低(P<0.001);與正常組相比,模型組Bcl-2表達(dá)量降低,三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸增高(P<0.001)。與正常組相比,模型組Bax/Bcl-2值顯著增高,三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸降低(P<0.001)。
   3 Pim-2在H2O2誘導(dǎo)的心肌

21、細(xì)胞損傷中的表達(dá)及作用
   3.1 H2O2顯著上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)用濃度為50μmol/L的H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞0.5、1、2、3、6h,實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)時發(fā)現(xiàn),H2O2干預(yù)后的心肌細(xì)胞Pim-2 mRNA的表達(dá)有所增加,各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。其中H2O20.5、1h組與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0

22、56);其余各濃度組與正常對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),尤其是H2O23h組Pim-2mRNA的水平增加最顯著;H2O26h組心肌細(xì)胞Pim-2 mRNA表達(dá)水平有所降低,但仍高于正常對照組。
   3.2 H2O2顯著上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2蛋白的表達(dá)應(yīng)用Western blot法檢測H2O2干預(yù)不同時間后心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2的蛋白水平發(fā)現(xiàn),H2O2干預(yù)后的心肌細(xì)胞Pim-2蛋白表達(dá)增高,其增高的趨勢與實(shí)時

23、熒光定量PCR檢測出的Pim-2mRNA增高趨勢一致,各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。
   3.3 Pim-2 siRNA干擾對細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組,H2O2組,siRNA組(H2O2+siRNA),陰性對照組(H2O2+NC)。結(jié)果顯示模型組與正常組相比,細(xì)胞凋亡率顯著增加,siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P<0.001),陰性對照組與模型組相比無顯著差異(P>0.05),與正常組相比顯著增加(P<0.

24、001)。
   3.4 Pim-2 siRNA干擾對細(xì)胞LDH、MDA、SOD的影響心肌細(xì)胞經(jīng)Pim-2siRNA干擾后,心肌細(xì)胞SOD活性較模型組顯著降低,而LDH、MDA含量較模型組顯著增高,各指標(biāo)組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<.001),陰性對照組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
   4 Pim-2蛋白表達(dá)調(diào)控
   4.1三七皂苷R1上調(diào)Pim-2蛋白的表達(dá)通過Western Blot技術(shù)

25、檢測各組心肌細(xì)胞Pim-2蛋白表達(dá),結(jié)果顯示模型組(H2O2)與正常組相比Pim-2表達(dá)顯著增高,三七皂苷R1各劑量組Pim-2表達(dá)進(jìn)一步增高,其中三七皂苷R1高劑量組表達(dá)增高最為顯著,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
   4.2 Pim-2 siRNA干擾對三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞凋亡率的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組(H2O2)、三七皂苷R1組(H2O2+NG R110μM)、siRNA轉(zhuǎn)染組(H2O2+NG R11

26、0μM+siRNA)、siRNA陰性對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率,結(jié)果模型組與正常組相比凋亡率顯著增高(P<0.001),三七皂苷R1組與模型組相比顯著下降,siRNA組、siRNA陰性對照組與三七皂苷R1組相比無顯著差異(P>0.05)。
   4.3 Pim-2 siRNA干擾對心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組,H2O2組,siRNA組(H2O2+siRNA),陰性對照組。用WB檢測各組細(xì)胞中Bax

27、、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化,分析目的條帶的光密度值(IOD),與正常組相比,(.)模型組Bax表達(dá)顯著增高,siRNA組與模型組相比表達(dá)進(jìn)一步增高(P<0.01),陰性對照組與模型組相比Bax表達(dá)無顯著差異。與正常組相比,模型組Bcl-2表達(dá)量降低,siRNA組與模型組相比表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.01),陰性對照組與模型組相比無顯著差異。模型組與正常組相比,Bax/Bcl-2值顯著增高,siRNA組進(jìn)一步增高(P<0.01),陰性對照組

28、無顯著差異。
   四、結(jié)論:
   1、H2O2能抑制心肌細(xì)胞活力,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,導(dǎo)致氧化平衡體系的破壞。三七皂苷R1可以抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力,保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞抗氧活酶活力。
   2、H2O2促進(jìn)心肌細(xì)胞ERK、JNK、P38的磷酸化,三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞中ERK的磷酸化,而對JNK、P38的磷酸化無顯著調(diào)控。三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預(yù)的心肌

29、細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。表明三七皂苷R1抗心肌細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)ERK信號通路、凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。
   3、H2O2能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Pim-2激酶的表達(dá),Pim-2 siRNA干擾可有效沉默Pim-2基因,Pim-2蛋白表達(dá)對心肌細(xì)胞損傷其保護(hù)作用。
   4、三七皂苷R1上調(diào)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞中Pim-2的表達(dá),但siRNA干擾Pim-2后,三七皂苷R1仍能抗心肌細(xì)胞凋亡,表明三七皂苷R1抗

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