三七總皂苷抗缺血誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：已有研究表明三七總皂苷（panax notoginseng saponin PNS ）對(duì)缺血心臟具有良好的保護(hù)作用，但是PNS 保護(hù)缺血心臟的具體分子作用機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。本課題擬探討PNS對(duì)缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是否有抑制作用，以及PNS 抑制細(xì)胞凋亡的可能分子作用機(jī)制。
　　 方法：將H9c2 細(xì)胞分為正常對(duì)照組（control ），模型組（model ）和PNS 不同濃度（0.01g/L,0.05g/L,0.25g/

2、L,0.5g/L, 0.75g/L, 2.25g/L和3.75g/L ）組。Control 組細(xì)胞用含10%血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基于普通二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，model 組細(xì)胞用無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)基同時(shí)缺氧（serum, glucose and oxygen deprivation, SGOD ）培養(yǎng)，給藥組細(xì)胞造模的同時(shí)給予不同濃度的PNS 溶液。Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率；JC-1染色檢測(cè)線粒體膜

3、電位；DCFH-DA染色檢測(cè)胞內(nèi)ROS 水平。結(jié)扎SD 雄性大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠心肌缺血模型，并將造模成功的大鼠分為心肌缺血組（ischemia ），PNS 低劑量組（PNS-L 30mg/kg/d ）和PNS 高劑量組（PNS-H 60mg/kg/d ），另設(shè)假手術(shù)組（sham ），sham組大鼠開(kāi)胸后只穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。術(shù)后第二天給藥組大鼠灌胃給予不同濃度PNS 溶液，sham和ischemia 組大鼠給予等容的生

4、理鹽水，連續(xù)灌胃六周。六周后超聲心動(dòng)圖檢查心功能，取心肌組織，冰凍切片后TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況。Wes t er nblot檢測(cè)caspase-3，cleaved caspase-3, bcl-2, Akt，MIF, AMPK, 磷酸化Akt（p-Akt ）和磷酸化AMPK（p-AMPK ）的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：PNS 能夠抑制SGOD 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性。各組細(xì)胞凋亡率分別為：co

5、ntrol 7.15%±1.56%, model 67.79%±3.74%（vs. Control P=0.000 ）, PNS處理組細(xì)胞凋亡率分別為65.58%±1.90%，66.99%±2.86%, 53.22%±3.62%（vs. ModelP=0.006), 37.34%±2.16%（vs. Model P=0.000 ），31.34%±2.52%（vs. Model P=0.000),24.42%±0.81%（vs. Mode

6、l P=0.000), 19.76%±5.21%（vs. Model P=0.000)。而PI3K 抑制劑LY294002，MIF 拮抗劑ISO-1和AMPK 抑制劑Compound C 都能夠逆轉(zhuǎn)PNS 抑制細(xì)胞凋亡的作用(P=0.000, P=0.003, P=0.000 vs. PNS2.25g/L)。PNS 能夠明顯的降低cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)水平，而LY294002 則逆轉(zhuǎn)了PNS 對(duì)caspas-3 活化

7、的抑制作用。JC-1染色結(jié)果表明PNS 具有穩(wěn)定線粒體膜電位的作用，DCFH-DA染色結(jié)果顯示PNS 具有清除胞內(nèi)ROS的作用。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示PNS-H 能夠升高心肌缺血大鼠EF 值（P=0.010 vs.ischemia)和FS 值（P=0.004 vs. Ischemia ），同時(shí)能夠降低大鼠LVDd（P=0.001 vs. Ischemia ）值和LVDs（P=0.000 vs. Ischemia ）值。PNS-L 對(duì)心功能也

8、有一定的改善作用，但是與ischemia比較組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUNEL染色結(jié)果顯示PNS-L和PNS-H 都能夠降低大鼠缺血心肌組織細(xì)胞凋亡率。此外PNS 還能夠顯著降低大鼠心肌組織中cleaved caspase-3 蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。Western blot 結(jié)果也表明，model 組p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P=0.000 vs. Control ），PNS 則能夠顯著升高p-Akt

9、蛋白的表達(dá)水平（P=0.004 vs. Model ），而PI3K 特異性抑制劑LY294002 有逆轉(zhuǎn)PNS 促進(jìn)p-Akt 蛋白表達(dá)的作用（P=0.002 vs. PNS 2.25g/L ）；與control 組比較model 組MIF和p-AMPK 蛋白表達(dá)水平升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047, P=0.006 vs. Control ），PNS 則能夠進(jìn)一步到升高M(jìn)IF和p-AMPK 蛋白的表達(dá)水平（P=0.043, P=0.

10、003 vs. Model ）。心肌組織蛋白western blot 結(jié)果也顯示PNS-L和PNS-H 都能夠升高p-Akt，MIF和p-AMPK 蛋白表達(dá)水平，與ischemia比較PNS-H 組p-Akt，MIF和p-AMPK 蛋白表達(dá)水平升高具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000,P=0.020, P=0.010 vs. Ischemia ）。
　　 結(jié)論：PNS 能夠抗線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其抗凋亡的機(jī)制與激活PI