核仁素在大鼠缺血-再灌注損傷心肌中的表達(dá)及其抗心肌細(xì)胞凋亡作用研究.pdf

1、缺血心肌恢復(fù)血流灌注過(guò)程中產(chǎn)生的心肌損傷，稱為心肌缺血-再灌注損傷，常見(jiàn)于冠心病等心血管疾病及體外循環(huán)下行開(kāi)心直視手術(shù)、心臟移植、冠脈搭橋術(shù)、冠脈溶栓術(shù)及成形術(shù)等心血管疾病治療過(guò)程。心肌缺血—再灌注損傷的發(fā)生涉及活性氧產(chǎn)生、鈣超載及能量代謝障礙等機(jī)制，其結(jié)果是導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡。核仁素是真核細(xì)胞核仁中最主要的一種磷酸蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，可調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、調(diào)控胚胎發(fā)生、胞質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制與核仁的發(fā)

2、生等過(guò)程。作為一種穿梭蛋白和細(xì)胞表面受體，核仁素參與多種物質(zhì)在細(xì)胞核與細(xì)胞漿之間的轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞核功能的細(xì)胞外調(diào)節(jié)。近年研究表明核仁素還在細(xì)胞凋亡發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在抗腫瘤藥物、紫外線照射等所致的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，伴有核仁素蛋白的表達(dá)下調(diào)、斷裂和轉(zhuǎn)位改變，而核仁素過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)核仁素是通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)分子如Bcl-2等mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控而發(fā)揮作用。然而，在心肌缺血—再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞凋

3、亡中，核仁素是否發(fā)揮作用及怎樣發(fā)揮作用，目前尚無(wú)相關(guān)研究。
　　 本研究首先觀察了大鼠缺血—再灌注損傷心肌中，細(xì)胞凋亡的發(fā)生及核仁素的表達(dá)情況；然后探討了核仁素對(duì)過(guò)氧化氫所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響；并進(jìn)一步探討了核仁素影響凋亡發(fā)生的具體機(jī)制。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1、核仁素在大鼠缺血—再灌注損傷心肌中的表達(dá)
　　 (1)大鼠心肌缺血—再灌注損傷模型的構(gòu)建：結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后再灌注不同時(shí)間

4、，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶及肌酸激酶-M明顯增多，心肌組織中活性氧生成增多。這提示心肌缺血—再灌注損傷模型構(gòu)建成功。(2)缺血—再灌注損傷對(duì)大鼠心肌凋亡的影響：心肌缺血30分鐘后再灌注不同時(shí)間，心肌組織中caspase-3活性升高，TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺血—再灌注損傷心肌中細(xì)胞凋亡發(fā)生增多，瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)缺血—再灌注損傷導(dǎo)致DNA-Ladder的形成。以上研究表明，心肌缺血—再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生增多。(3)缺血

5、—再灌注損傷對(duì)大鼠心肌中核仁素表達(dá)的影響：心肌缺血30分鐘后再灌注不同時(shí)間，心肌組織中的核仁素mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯降低，且核仁素蛋白發(fā)生斷裂，即從110kD的全長(zhǎng)分子斷裂形成一約80kD的分子。上述結(jié)果表明心肌缺血—再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生增多，核仁素表達(dá)下調(diào)并發(fā)生斷裂。
　　 2、核仁素對(duì)H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　 (1)核仁素在大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的時(shí)空表達(dá)模式：將新生大鼠原代心肌細(xì)胞暴露于

6、0.5mmol/ L H2O2，發(fā)現(xiàn)核仁素的mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯降低、核仁素蛋白發(fā)生斷裂，且在正常情況下大部分核仁素分布在心肌細(xì)胞核，H2O2處理則導(dǎo)致核仁素向胞漿移位。(2)核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：應(yīng)用核仁素真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)核仁素過(guò)表達(dá)能明顯抑制H2O2所致的心肌細(xì)胞caspase-3活性升高及細(xì)胞凋亡發(fā)生。(3)核仁素低表達(dá)對(duì)H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制核

7、仁素的表達(dá)，則發(fā)現(xiàn)核仁素低表達(dá)能進(jìn)一步升高H2O2所致的的心肌細(xì)胞caspase-3活性及凋亡發(fā)生。以上結(jié)果表明，在H2O2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷中，核仁素表達(dá)下調(diào)并發(fā)生斷裂，核仁素對(duì)H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。
　　 3、核仁素抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　 (1)核仁素不同結(jié)構(gòu)域?qū)2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：由于在核仁素的氨基端分布有其酶解位點(diǎn)，我們推測(cè)氧化應(yīng)激損傷時(shí)形成的80kD核仁素分子是

8、切除了氨基端的核仁素片段，因而我們選用了核仁素氨基端和核仁素羧基端兩個(gè)突變體來(lái)探討核仁素抗凋亡的可能機(jī)制。將核仁素不同結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)單純轉(zhuǎn)染對(duì)caspase-3活性及細(xì)胞凋亡發(fā)生率無(wú)明顯影響；H2O2處理后，caspase-3活性及細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯升高，轉(zhuǎn)染核仁素氨基端片段)后caspase-3活性低于轉(zhuǎn)染空載體心肌細(xì)胞組，而轉(zhuǎn)染核仁素羧基端片段后，心肌細(xì)胞caspase-3活性及凋亡發(fā)生率則明顯高于轉(zhuǎn)染空載

9、體心肌細(xì)胞組。這提示核仁素氨基端(AA1-309)具有部分抗凋亡作用，而核仁素羧基端則具有促凋亡作用。
　　 (2)核仁素及其不同結(jié)構(gòu)域?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響：
　　 將核仁素RNA干擾片段、核仁素全長(zhǎng)或其不同結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2在核仁素過(guò)表達(dá)心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，在RNA干擾所致核仁素低表達(dá)的心肌細(xì)胞中明顯下調(diào)，但在核仁素氨基端片段或羧基端片段過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，Bcl-

10、2表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有明顯差異。而促凋亡基因Bax則在核仁素過(guò)表達(dá)心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，在核仁素低表達(dá)心肌細(xì)胞中明顯上調(diào)；Bax在核仁素氨基端片段過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯改變，而在核仁素羧基端片段過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，Bax表達(dá)增高。上述結(jié)果提示核仁素可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)并抑制Bax的表達(dá)，而核仁素羧基端則促進(jìn)Bax的表達(dá)。
　　 H2O2處理后，心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，核仁素過(guò)表達(dá)可抑制H2O2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào)，

11、核仁素RNA干擾可促進(jìn)H2O2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào)，但核仁素氨基端片段或羧基端片段過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào)沒(méi)有明顯影響；與此相反，H2O2處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞的Bax表達(dá)上調(diào)，核仁素過(guò)表達(dá)可抑制H2O2所致的Bax表達(dá)上調(diào)，核仁素RNA干擾或核仁素羧基端片段過(guò)表達(dá)可促進(jìn)H2O2所致的Bax表達(dá)上調(diào)，但核仁素氨基端片段過(guò)表達(dá)對(duì)H2O2所致的Bax表達(dá)上調(diào)沒(méi)有明顯影響。以上結(jié)果說(shuō)明在H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞損傷中，核仁素通

12、過(guò)增加Bcl-2表達(dá)、減少Bax表達(dá)而抑制心肌細(xì)胞凋亡；核仁素羧基端則通過(guò)增加Bax表達(dá)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 (3)核仁素及其不同結(jié)構(gòu)域?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA穩(wěn)定性的影響：
　　 收集放射菌素D處理后的不同心肌細(xì)胞組，用real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA水平，發(fā)現(xiàn)正常情況下核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響，核仁素低表達(dá)則導(dǎo)致心肌細(xì)胞的Bcl-2 mRN

13、A穩(wěn)定性降低；經(jīng)H2O2處理后，大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2mRNA穩(wěn)定性降低，但核仁素過(guò)表達(dá)能抑制H2O2所致的Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性下降，核仁素氨基端片段過(guò)表達(dá)則對(duì)H2O2所致的Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性的下降沒(méi)有明顯影響；上述結(jié)果提示核仁素通過(guò)增加Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性，使Bcl-2表達(dá)增多而抑制氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 而核仁素過(guò)表達(dá)或低表達(dá)以及核仁素氨基端片段\過(guò)表達(dá)，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的Bax mRNA穩(wěn)定

14、性沒(méi)有明顯影響；但核仁素羧基端片段\過(guò)表達(dá)則明顯增加了Bax mRNA的穩(wěn)定性；經(jīng)H2O2處理后，大鼠心肌細(xì)胞中Bax mRNA穩(wěn)定性增高，核仁素過(guò)表達(dá)則明顯抑制了H2O2所致的Bax mRNA穩(wěn)定性增高。以上結(jié)果表明在H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞損傷中，核仁素通過(guò)降低BaxmRNA穩(wěn)定性，使Bax表達(dá)減少而發(fā)揮抗凋亡的作用；核仁素羧基端\則通過(guò)增加Bax mRNA的穩(wěn)定性，使Bax表達(dá)增多而發(fā)揮促凋亡作用。
　　 (4)核仁素與

15、凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA的相互作用：抽提正?；虮┞队贖2O2的大鼠心肌細(xì)胞裂解液，應(yīng)用核仁素抗體進(jìn)行免疫沉淀后，對(duì)沉淀物中的mRNA分子進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果表明，在正常大鼠心肌細(xì)胞中，核仁素可與Bcl-2 mRNA結(jié)合，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí)，核仁素與Bcl-2 mRNA結(jié)合減少；平行的Western blot結(jié)果顯示在正常情況下，主要為110kD的核仁素全長(zhǎng)分子，H2O2處理后，110kD核仁素明顯減少，形成大量

16、的80kD斷裂片段；以上結(jié)果提示核仁素可能是通過(guò)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)分子與Bcl-2 mRNA結(jié)合而增加其穩(wěn)定性。
　　 與此相反，在正常大鼠心肌細(xì)胞中核仁素與Bax mRNA結(jié)合很少，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí)，核仁素與Bax mRNA結(jié)合增多；結(jié)合上述平行的Western blot結(jié)果，我們推論，與Bax mRNA結(jié)合的核仁素主要是80kD的片段。正常狀態(tài)下，80kD的核仁素片段較少，氧化應(yīng)激損傷時(shí)，核仁素80kD片段增多。該片段可能與B

17、ax mRNA結(jié)合而增加后者的穩(wěn)定性。
　　 綜上所述，核仁素是一重要抗凋亡蛋白，在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用。在缺血-再灌注損傷大鼠心肌及氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞中，核仁素表達(dá)下調(diào)且核仁素蛋白發(fā)生斷裂，這可能是心肌缺血-再灌注損傷及氧化應(yīng)激損傷發(fā)生的重要機(jī)制。在正常情況下核仁素大部分位于心肌細(xì)胞胞核，氧化應(yīng)激損傷時(shí)核仁素向胞漿移位。在正常大鼠心肌細(xì)胞中，核仁素可與Bcl-2 mRNA、Bax mRNA結(jié)合；細(xì)胞氧化應(yīng)

18、激損傷時(shí)，核仁素與Bcl-2 mRNA結(jié)合減少、與Bax mRNA結(jié)合增多。氧化應(yīng)激損傷時(shí)，核仁素全長(zhǎng)蛋白分子通過(guò)與Bcl-2 mRNA結(jié)合增加其穩(wěn)定性、與Bax mRNA結(jié)合降低Bax mRNA穩(wěn)定性，從而增加Bcl-2蛋白表達(dá)、減少Bax蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用；核仁素羧基端結(jié)構(gòu)域則通過(guò)增加Bax mRNA穩(wěn)定性使Bax表達(dá)增多而發(fā)揮促凋亡作用。心肌缺血-再灌注損傷及氧化應(yīng)激損傷可能通過(guò)減少110kD的核仁素全長(zhǎng)蛋白質(zhì)分子與Bcl-