MicroRNA-7a-b在缺血-再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們生活方式改變和人口老齡化，目前，缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要原因之一。我國現(xiàn)有缺血性心臟病患者超過2000萬人，且每年新增患者100萬人左右。急性冠狀動(dòng)脈閉塞所致的急性心肌梗死是缺血性心臟病中非常嚴(yán)重的一類疾病，及時(shí)開通梗死相關(guān)動(dòng)脈、恢復(fù)血流供應(yīng)是挽救瀕死心肌的關(guān)鍵;但是，研究發(fā)現(xiàn)心肌持續(xù)一段時(shí)間缺血后重新恢復(fù)血流灌注會(huì)給心臟組織帶來新的

2、損傷，出現(xiàn)心肌頓抑、心功能降低、惡性心律失常發(fā)作等，即心臟缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/RI)。缺血/再灌注損傷的概念是在1960年由Jennings等人首次提出的。研究發(fā)現(xiàn)，心臟缺血/再灌注損傷與氧自由基釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、心肌能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡等有關(guān)。研究心臟缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，探討在盡早恢復(fù)缺血組織血流灌注的同時(shí)，減少甚至消除缺血/再灌注

3、損傷的發(fā)生成為臨床治療中一個(gè)新的挑戰(zhàn)。
　　MicroRNA(miRNA)是一類由21～23個(gè)堿基組成的、內(nèi)源性的非編碼的單鏈小分子RNA，通過對(duì)mRNA的降解或者翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管系統(tǒng)中表達(dá)豐富，參與了心臟發(fā)育、心肌重塑、心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡、心律失常、心力衰竭等病理生理過程。近年來，miRNA在心臟缺血/再灌注損傷中的調(diào)控作用越來越受到人們的重視。vanRooij等研

4、究發(fā)現(xiàn)，在非熱休克導(dǎo)致的心臟缺血/再灌注損傷的小鼠體內(nèi)注入miR-1、miR-21和miR-24可以減少心肌梗死范圍。作為心肌特異性表達(dá)的miRNA，miR-1在心臟缺血/再灌注損傷過程中起著重要作用。Ren等研究發(fā)現(xiàn)，miR-320在心臟缺血/再灌注損傷中表達(dá)明顯降低，敲除miR-320可以使熱休克蛋白20(heat-shockprotein20，Hsp20)表達(dá)增加，從而減少心臟缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　Ren

5、等在研究心臟缺血/再灌注損傷中miR-320的作用時(shí)，通過基因芯片發(fā)現(xiàn)miR-7表達(dá)升高。近年來有研究發(fā)現(xiàn)miR-7是一種腫瘤抑制因子，在多種腫瘤，如肺癌、舌鱗狀細(xì)胞癌及惡性成神經(jīng)細(xì)胞瘤中抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;但是，關(guān)于miR-7在心臟缺血/再灌注損傷中表達(dá)的變化，以及miR-7在心臟缺血/再灌注損傷中的作用及其機(jī)制尚不清楚。
　　近年來，有一種與細(xì)胞損傷有關(guān)的酶——多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribos

6、e)polymerase，PARP]引起人們的重視。PARP是在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一類蛋白酶類家族，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用。主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞漿內(nèi)。目前發(fā)現(xiàn)至少有18個(gè)家族成員，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase1,Tankyrase2等。PARP在DNA的損傷修復(fù)、基因表達(dá)、維持染色質(zhì)的穩(wěn)定、細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和壞死以及基因轉(zhuǎn)錄等多種生理、病理過程中起

7、重要作用。細(xì)胞在受到外源性有害因子刺激時(shí)DNA損傷，PARP在DNA損傷斷裂時(shí)被激活并參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)，為防止NAD+和ATP的大量消耗，激活的Caspase-3裂解PARP，從而使PARP失活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明PARP在心臟缺血/再灌注損傷、心肌梗死、心力衰竭、腦血管疾病、糖尿病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。
　　盡管miRNA和PARP在心臟缺血/再灌注損傷中的重要作用均有研究，但其中

8、發(fā)生機(jī)制卻遠(yuǎn)未清楚。例如miR-7在心臟缺血/再灌注損傷中表達(dá)是否發(fā)生變化？它又是如何變化的？miR-7是否通過PARP對(duì)心臟缺血/再灌注損傷產(chǎn)生影響？二者又是怎樣的關(guān)系？具體作用如何？這些問題構(gòu)成了本研究的課題內(nèi)容。在本研究中，我們擬通過建立心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注（缺氧/復(fù)氧）損傷模型和大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型，從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)行深入研究，探討miR-7在心臟缺血/再灌注損傷中的作用及其作用機(jī)制，這可能為心臟缺血/再

9、灌注損傷的臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　本研究共分三部分進(jìn)行:
　　第一部分：體外試驗(yàn):MiRNA-7a/b在心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷中的表達(dá)變化及其對(duì)缺血/再灌注損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響;
　　第二部分：體外試驗(yàn):MiRNA-7a/b通過抑制PARP減少缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;
　　第三部分：體內(nèi)試驗(yàn):MiRNA-7a/b減少大鼠心臟缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷。
　　第一部分：體外試驗(yàn):Mi

10、RNA-7a/b在心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷中的表達(dá)變化及其對(duì)缺血/再灌注損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
　　研究目的：
　　本研究擬培養(yǎng)Wistar大鼠原代心肌細(xì)胞和H9C2心肌細(xì)胞，體外建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，測(cè)定miR-7a/b的表達(dá);并通過在H9C2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor來調(diào)控miR-7a/b的表達(dá)，測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率和乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase

11、，LDH)水平，明確miR-7a/b在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中的表達(dá)變化及其對(duì)缺氧/復(fù)氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法：
　　1.原代心肌細(xì)胞的提取:取2日齡Wistar大鼠乳鼠，開胸取心臟，將心臟剪碎成約1mm3大小，應(yīng)用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶多次消化，收集細(xì)胞，差速貼壁純化心肌細(xì)胞后種板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注損傷模型的建立和分組:取不含血清、不含糖的DMEM培養(yǎng)基做為缺氧液置換培

12、養(yǎng)基，置于37℃密閉的低氧培養(yǎng)箱中(95％N2和5％CO2)培養(yǎng)，其中95％N2和5％CO2混合氣體以2L/min的流速通氣置換空氣。缺氧后置換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)建立心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注損傷模型。
　　原代心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分以下2組:對(duì)照組（Control組）和模擬缺血/再灌注組（SI/R組）;
　　H9C2心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分以下10組:Control組、Control+miR-7amimic組、Control+miR-7bmi

13、mic組、Control+miR-7ainhibitor組、Control+miR-7binhibitor組、SI/R組、SI/R+miR-7amimic組、SI/R+miR-7bmimic組、SI/R+miR-7ainhibitor組、SI/R+miR-7binhibitor組。
　　3.Real-timePCR檢測(cè)miR-7a和miR-7b的表達(dá):使用mirVanaTMmiRNA提取試劑盒提取心肌細(xì)胞中的miRNAs，并用Ta

14、qmanmiRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后使用TaqmanmiRNA引物和TaqManUniversalPCRMasterMix檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-7a和miR-7b的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照。
　　4.miR-7a/bmimic和miR-7a/binhibitor的轉(zhuǎn)染:使用Lipofectamine2000分別將miR-7a/bmimic和miR-7a/binhibitor轉(zhuǎn)染入H9C2心肌細(xì)胞。
　　5.心肌細(xì)胞凋

15、亡的檢測(cè):使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　6.細(xì)胞LDH的測(cè)定:采用LDH檢測(cè)試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞的LDH水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后miR-7a和miR-7b升高:在原代心肌細(xì)胞和H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，miR-7a和miR-7b的表達(dá)均明顯升高;說明miR-7a和miR-7b參與了心臟缺血/再灌注損傷;
　　2.在缺氧/復(fù)氧后，心肌細(xì)胞凋亡率增加，LDH水平升高:H9

16、C2心肌細(xì)胞在缺氧10小時(shí)、復(fù)氧2小時(shí)后細(xì)胞凋亡率明顯增加，LDH水平顯著升高;
　　3.miR-7a和miR-7b在缺氧/復(fù)氧條件下對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響:在H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，與SI/R組相比，轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic可顯著減少心肌細(xì)胞的凋亡率和LDH的釋放;相反，miR-7a/binhibitor增加心肌細(xì)胞凋亡率和LDH水平;
　　以上結(jié)果表明，miR-7a/b在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中發(fā)揮重要作用，過

17、表達(dá)miR-7a/b可顯著降低缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。
　　結(jié)論:
　　1.體外建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，miR-7a/b表達(dá)明顯升高;
　　2.體外建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，miR-7a/bmimic可減少心肌細(xì)胞凋亡率、降低LDH水平;相反，miR-7a/binhibitor增加心肌細(xì)胞凋亡率、升高LDH水平。
　　第二部分：體外試驗(yàn):MiRNA-7a/b通過抑制PARP減少缺血/再灌注損傷誘

18、導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　研究目的：
　　通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件分析miRNA有可能發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及WesternBlot技術(shù)驗(yàn)證PARP是否是miR-7a/b的靶基因;體外建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，并通過miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，應(yīng)用WesternBlot技術(shù)測(cè)定靶基因的表達(dá)及其對(duì)凋亡的影響，并探討miR-7a/b在心肌細(xì)胞缺血

19、/再灌注損傷中的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立和分組:取不含血清、不含糖的DMEM培養(yǎng)基做為缺氧液置換培養(yǎng)基，置于37℃密閉的低氧培養(yǎng)箱中（95％N2和5％CO2）培養(yǎng)，其中95％N2和5％CO2混合氣體以2L/min的流速通氣置換空氣。缺氧后置換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)建立心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注損傷模型。
　　H9C2心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分以下10組:Control組、Control+miR-7

20、amimic組、Control+miR-7bmimic組、Control+miR-7ainhibitor組、Control+miR-7binhibitor組、SI/R組、SI/R+miR-7amimic組、SI/R+miR-7bmimic組、SI/R+miR-7ainhibitor組、SI/R+miR-7binhibitor組。
　　2.miR-7a/bmimic和miR-7a/binhibitor的轉(zhuǎn)染:使用Lipofectam

21、ine2000分別將miR-7a/bmimic和miR-7a/binhibitor轉(zhuǎn)染入H9C2心肌細(xì)胞，并以scramblecontrolmiRNA作為陰性對(duì)照。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):為檢測(cè)miR-7a/b是否能與PARP的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'-UTR)的mRNA結(jié)合，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的方法。構(gòu)建GV126-PARP3'-UTR野生型(GV126-PARP3'-

22、UTR-WT)和突變型(GV126-PARP3'-UTR-MU)報(bào)告基因載體，我們將miR-7a/bmimic和這些報(bào)告基因載體及海腎素表達(dá)質(zhì)粒(pRL-TKvector)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞后，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)并分析其熒光素酶活性，確定miRNA的作用靶點(diǎn)。
　　HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分以下5組:MiRcontrol+GV126+pRL-TK組、Mimic-7a+GV126-3'UTR-WT+pRL-TK組、M

23、imic-7b+GV126-3'UTR-WT+pRL-TK組、Mimic-7a+GV126-3'UTR-MU+pRL-TK組、Mimic-7b+GV126-3'UTR-MU+pRL-TK組;
　　4.WesternBlot檢測(cè)表達(dá)變化的miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的影響及其在心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷中對(duì)凋亡的影響:將miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞后，應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)靶

24、基因表達(dá)的變化，確定miRNA對(duì)靶基因的影響;心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor后制做缺氧/復(fù)氧損傷模型，WesternBlot檢測(cè)PARP和Caspase-3及其裂解片段的表達(dá)，明確其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.在H9C2心肌細(xì)胞中，PARP是miR-7a/b的靶基因:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic后，攜帶有PARP野生型

25、報(bào)告基因載體組的熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，而攜帶有PARP突變型報(bào)告基因載體組熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度沒有明顯變化;WesternBlot結(jié)果也顯示，過表達(dá)miR-7a/b可使PARP的表達(dá)降低，相反，抑制miR-7a/b的表達(dá)后，PARP的表達(dá)明顯升高;
　　以上結(jié)果充分證明了在H9C2心肌細(xì)胞中，miR-7a/b可以調(diào)控PARP蛋白的表達(dá)，說明PARP是miR-7a/b的靶基因。
　　2.在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中，miR-7a

26、/b的表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響:WesternBlot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中，PARP表達(dá)顯著減少，但PARP和Caspase-3裂解片段的表達(dá)升高，提示心肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡;過表達(dá)miR-7a/b可以降低裂解片段的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡;相反，抑制miR-7a/b使裂解片段表達(dá)明顯增加，加重了心肌細(xì)胞凋亡;
　　以上結(jié)果表明，miR-7a/b可以通過抑制PARP的表達(dá)減少在缺血/再灌注損傷中的心肌

27、細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌。
　　結(jié)論
　　1.在H9C2心肌細(xì)胞中，PARP是miR-7a/b的靶基因;
　　2.體外建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中，miR-7a/b通過與PARP的3'-UTR相互作用，從而抑制其蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：體內(nèi)試驗(yàn):MiRNA-7a/b減少大鼠心臟缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷
　　研究目的：
　　本研究擬制作Wistar大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型，測(cè)定

28、心肌組織miR-7a/b的表達(dá);并通過心肌內(nèi)直接注射慢病毒轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor，測(cè)定PARP的表達(dá)及心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡和血清LDH水平的變化，探討miR-7a/b在心臟缺血/再灌注損傷中的表達(dá)變化、miR-7a/b在心臟缺血/再灌注中對(duì)心肌損傷的影響及其作用機(jī)制。進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論。
　　研究方法
　　1.Wistar大鼠心臟缺血/再灌注（ischemia/re

29、perfusion，I/R）損傷模型的建立及分組:采用開胸結(jié)扎和松開冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R模型。
　　實(shí)驗(yàn)一:miR-7a/b在大鼠心臟I/R損傷中表達(dá)變化的研究。實(shí)驗(yàn)分為以下2組:sham組和I/R組。每組8只大鼠;
　　實(shí)驗(yàn)二:驗(yàn)證PARP是否是miR-7a/b的靶基因。實(shí)驗(yàn)分為以下5組:NC組、miR-7amimic組、miR-7bmimic組、miR-7ainhibitor組、miR-7binhibitor

30、組。每組8只大鼠;
　　實(shí)驗(yàn)三:miR-7a/b在大鼠心臟I/R損傷中作用的研究。實(shí)驗(yàn)分為以下7組:sham組、I/R組、I/R+NC組、I/R+miR-7amimic組、I/R+miR-7bmimic組、I/R+miR-7ainhibitor、I/R+miR-7binhibitor。每組16只大鼠。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染:采用心肌內(nèi)直接注射的方法將攜帶有miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor的慢病毒轉(zhuǎn)

31、染大鼠心肌調(diào)控miR-7a/b的表達(dá)，并以轉(zhuǎn)染空病毒組作為陰性對(duì)照(NC)。
　　3.Real-timePCR檢測(cè)miR-7a和miR-7b的表達(dá):使用TRIzol提取心肌組織中的總RNA，并用TaqmanmiRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后使用TaqmanmiRNA引物和TaqManUniversalPCRMasterMix檢測(cè)心肌中miR-7a和miR-7b的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照。
　　4.Real-timePCR檢

32、測(cè)PARP的表達(dá):利用TRIzol提取心肌組織中的總RNA，使用日本TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒將樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)心肌中PARP的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物由上海博尚生物公司合成。
　　5.WesternBlot檢測(cè)PARP的表達(dá):將攜帶有miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor的慢病毒轉(zhuǎn)染心肌7天后，W

33、esternBlot檢測(cè)PARP的表達(dá)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證PARP是否是miR-7a/b的靶基因。
　　6.心肌梗死范圍測(cè)定:采用Evans藍(lán)染色和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色來鑒別非缺血心肌、缺血心肌和梗死心肌:呈藍(lán)色的部分為非缺血心肌，呈紅色部分為缺血心肌，呈白色部分為梗死心肌。以稱重法計(jì)算缺血心肌和梗死心肌的重量，心肌梗死范圍的大小以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示

34、。
　　7.心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè):采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。
　　8.血清LDH測(cè)定:采用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清LDH水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.Wistar大鼠在心臟缺血/再灌注損傷后miR-7a和miR-7b升高:與對(duì)照組相比，在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中，miR-7a和miR-7b的表達(dá)均明顯升高;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明了miR-7a和

35、miR-7b參與了心臟缺血/再灌注損傷;
　　2.通過心肌內(nèi)直接注射，可成功轉(zhuǎn)染慢病毒:采用心肌內(nèi)直接注射的方法將攜帶有miR-7a/bmimic或miR-7a/binhibitor的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠心肌來調(diào)控miR-7a/b的表達(dá);慢病毒轉(zhuǎn)染7天后，熒光顯微鏡下觀察大鼠心肌組織中有綠色熒光蛋白(GreenFluoreseentProtein，GFP)的表達(dá)，并且陽性率均達(dá)到80％以上;同時(shí)，采用Real-timePCR方法檢測(cè)了心

36、肌組織中miR-7a和miR-7b的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic慢病毒后大鼠心肌組織中miR-7a和miR-7b的表達(dá)水平均明顯升高，而轉(zhuǎn)染攜帶有miR-7a/binhibitor的慢病毒后大鼠心肌組織中miR-7a和miR-7b的表達(dá)均顯著降低;
　　以上結(jié)果證明了在大鼠心肌中成功轉(zhuǎn)染了慢病毒。
　　3.mir-7a和mir-7b抑制PARP表達(dá):大鼠心肌中轉(zhuǎn)染miR-7a/bmimic或m

37、iR-7a/binhibitor慢病毒7天后應(yīng)用WesternBlot的方法檢測(cè)心肌組織PARP的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-7a/bmimic抑制PARP的蛋白表達(dá)，miR-7a/binhibitor使PARP表達(dá)升高;
　　與體外實(shí)驗(yàn)一致，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明了PARP是miR-7a/b的靶基因。
　　4.在心臟缺血/再灌注損傷中，miR-7a/b負(fù)性調(diào)控靶基因:應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)測(cè)定PARP的表達(dá)，與UR

38、+NC組相比，成功轉(zhuǎn)染含有miR-7a/bmimic的慢病毒后，心肌組織中PARP的表達(dá)降低，相反，轉(zhuǎn)染攜帶有miR-7a/binhibitor的慢病毒可以增加PARP的表達(dá);
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中PARP是miR-7a/b的靶基因。
　　5.在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中，miR-7a/b的表達(dá)變化對(duì)心肌損傷產(chǎn)生影響:在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中，與I/R+NC組相比，轉(zhuǎn)染攜帶有mi

39、R-7a/bmimic的慢病毒可顯著減少心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率及LDH水平;相反，轉(zhuǎn)染攜帶有miR-7a/binhibitor的慢病毒增加心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率及LDH釋放;
　　以上結(jié)果表明，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了miR-7a/b在心臟缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，過表達(dá)miR-7a/b可保護(hù)缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷。
　　結(jié)論：
　　1.在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中，miR-7a/b的表達(dá)明顯升高;

40、
　　2.在大鼠心肌中，PARP是miR-7a/b的靶基因。
　　3.在大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型中，miR-7a/b通過抑制PARP的表達(dá)，具有心臟保護(hù)作用。
　　創(chuàng)新性及局限性：
　　1.創(chuàng)新性
　　(1)本研究首次證實(shí)了在大鼠心臟缺血/再灌注損傷中，miR-7a/b的表達(dá)升高;
　　(2)本研究首次證實(shí)了PARP是miR-7a/b的靶基因，并且在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中證明了miR-7a/b通過調(diào)節(jié)PA