BMP-7對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用及對核因子-κB p65核轉移的影響.pdf

1、本文擬利用基因轉染技術將重組鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rrBMP-7)基因轉染心肌細胞，從細胞水平和器官水平探討B(tài)MP-7基因和重組蛋白對心肌細胞缺血再灌注損傷的影響及其機制，為缺血再灌注損傷的防治提供新的途徑。 研究材料與方法： 實驗動物：生后72h wistar乳大鼠，雌雄不拘，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。 心肌細胞的制備與培養(yǎng)：斷頸法處死乳大鼠后無菌條件下摘取左心室，D-Hank’s液洗去殘血，分離出附著組

2、織，剪成1 mm<'3>左右碎塊。采用差速貼壁法制備心肌細胞。前36h培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷0.1mmol/L抑制非心肌細胞增殖。細胞爬片后以α-肌動蛋白免疫組化鑒定心肌細胞純度為95％以上。培養(yǎng)成活3d的心肌細胞，傳至35mm培養(yǎng)皿(含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)皿的細胞數在2×10<'5>個左右。 實驗一：隨機分4組：pcDNA3.1-rrBMP-7質粒組(轉染實驗組)、pcDNA3.1組(空載體對照組

3、)、FuGENE 6轉染試劑對照組和細胞空白對照組。pcDNA3.1(+)-rrBMP-7構建后進行pcDNA3.1-rrBMP-7擴增、純化和鑒定。將含pcDNA3.1-rrBMP-7基因的質粒2μl與FuGENE 6轉染試劑98μl混合，室溫下靜置30rain后將此混合物加入實驗組細胞，37℃、5％CO<,2>條件下培養(yǎng)箱中轉染72h后觀察BMP-7表達情況。空載體組轉染只含pcDNA3.1的質粒；FuGENE 6轉染試劑對照組細胞

4、轉染的混合物中不加質粒，加入等量PBS；細胞空白對照組細胞不加轉染試劑，加入等量PBS。逆轉錄-PCR法檢測轉染rrBMP-7基因mRNA的表達。免疫細胞化學和Western blot法檢測BMP-7在心肌細胞中的表達。 實驗二：隨機分為3組，正常對照組(C組)：未經缺血/再灌注處理；模擬缺血再灌注組(IR組)：培養(yǎng)的心肌細胞缺氧120min，復氧240min；基因轉染組(BT組)：轉染BMP-7基因后，再行缺氧120min/復

5、氧240min。每組重復8次。模擬缺血再灌注組和基因轉染組細胞吸去細胞培養(yǎng)液，換用95％N<,2>+5％CO<,2>混合氣體飽和30min的無糖DMEM培養(yǎng)液2ml，置于缺氧罐中缺氧培養(yǎng)2h，復制“缺血”模型。再灌注期取出培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液換用混合空氣飽和的．DMEM 2ml，放回5％二氧化碳孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。對照組細胞一直置于CO<,2>培養(yǎng)箱中，基因轉染組缺血/再灌注損傷處理前進行基因轉染。心肌細胞搏動計數和觀察形態(tài)學變化。采用臺盼

6、藍排斥法檢測心肌細胞存活率。應用流式細胞儀PI染色法和TLINEL法測定細胞凋亡率。測定心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)含量，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。熒光成像系統(tǒng)測定細胞內鈣離子濃度。免疫細胞化學和Western blot法檢測NF-κB p65在心肌細胞核中的表達。以細胞核中出現棕黃色顆粒為NF-κB p65陽性結果。 實驗三：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，隨機分為單純缺

7、血再灌注組(IR組)，心肌缺血再灌注+BMP-7治療組(B組)和假手術對照組(Sham組)。各組分設缺血30mim后再灌注4h和24h時相點，Sham組只設4h時相點作總體對照；另用32只大鼠隨機分為缺血再灌注組和缺血再灌注+BMP-17治療組，以行TTC染色測定心肌梗死范圍。B組于再灌注前股靜脈給予rhBMP-7 250gg/kg，Sham組和IR組給予等量生理鹽水。于實驗結束時取心腔內血檢測LDH和CPK含量，心肌勻漿檢測MDA含量

8、、SOD活性，TTC法測定心肌梗死面積，HE和電鏡下觀察心肌組織學變化。TUNEL法測定細胞凋亡。免疫組織化學和Western blot檢測NF-κB p65在心肌細胞核中的表達。 所有數據以平均數±標準差表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間比較采用t檢緞驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 實驗結果 實驗一：入門載體質粒pMD 18-T Simple-BMP-7 DNA測序結果和IGene Ban

9、k中所提供的已知序列(XM342591)進行比對，結果表明，所克隆的BMP-7 cDNA從起始密碼子到終止密碼子共1293bp，與已知序列完全一致。將質粒pcDNA3.1-BMP-7用HindⅢ/BamHⅠ進行酶切檢測，釋放出5406bp載體片段和1293bp BMP-7片段。RT-PCR結果中，實驗組出現471bp條帶，表明實驗組心肌細胞中有BMP-7基因在mRNA水平的表達；空載體組、FuGENE 6轉染試劑對照組和細胞空白對照組則

10、無相應條帶出現。實驗組轉染質粒pcDNA3.1-BMP-7后，在心肌細胞胞質中有BMP-7表達，呈棕黃色。Western blot檢測到大小為18kD的特異性蛋白質條帶。 實驗二：模擬缺血/再灌注組(IR組)的細胞存活率降低?；蜣D染組的細胞存活率明顯高于缺血/再灌注組。與對照組相比，IR組搏動頻率明顯減慢，基因轉染組搏動頻率明顯高于IR組。對照組可見小亞二倍體峰；瓜組凋亡率明顯增加。而BMP-7基因轉染預處理則使細胞大部分存活

11、，凋亡率明顯低于瓜組。心肌細胞再灌注后LDH、CPK和MDA含量較正常心肌細胞顯著升高。BMP-7基因轉染預處理后LDH活性較IR組明顯降低。IR組SOD活性較正常對照組明顯下降，BMP-7基因轉染預處理后SOD活性均較IR組升高(P<0.01)。細胞內鈣離子測定結果顯示，IR給[Ca<'2+>濃度較正常對照組明顯升高(P<0.01)，BMP-7基因轉染預處理后[Ca<'2+>]含量較IR組降低(P<0.01)。IRNNF-κB p65

12、核染色和蛋白積分光密度比與正常對照組相比顯著性增高(P<0.01)。BMP-7基因轉染預處理后減少了NF-κBp65核染色和積分光密度比(P<0.01)。 實驗三：心肌缺血/再灌注過程中各組MDA、SOD、LDH和CPK含量變化與Sham組相比，IR4h組和24h組的MDA、LDH和CPK含量均明顯升高，SOD活性降低(P<0.01)，表明IR組心肌組織因缺血/再灌注損傷造成氧自由基和酶學的改變。B組MDA、LDH和NCPK含量

13、與IR組相比明顯減少，與IR組比較差異有顯著性(P<0.01)；SOD較IR組明顯恢復(P<0.01)。與R組同時點相比，B組梗死心肌重量(IS)及其占缺血危險區(qū)心肌重量百分比(IR/AAR％)均顯著減少(P<0.01)。電鏡超微結構觀察發(fā)現，Sham組心肌細胞超微結構未見明顯異常；IR組心肌細胞超微結構損傷嚴重；與IR組比較，B組心肌細胞超微結構損傷均有不同程度的改善。TUNEL法測定細胞凋亡結果顯示，與IR組相比，B組凋亡細胞明顯減

14、少。IR組NF-κB p65核染色和積分光密度比與正常對照組相比顯著性增高(P<0.01)；BMP-7基因轉染預處理后減少了NF-κB p65核染色和積分光密度比(P<0.01)。 研究結論： 1、應用本文介紹的方法，成功地構建了BMP-7真核表達質粒并在心肌細胞中大量表達，為應用于抗缺血再灌注損傷的研究創(chuàng)造了條件。 2、BMP-7轉染可對抗缺氧復氧對心肌細胞的損傷，其機制與提高心肌細胞抗氧化損傷能力，對抗缺氧復