BMP-7對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)核因子-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、本文擬利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rrBMP-7)基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，從細(xì)胞水平和器官水平探討B(tài)MP-7基因和重組蛋白對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制，為缺血再灌注損傷的防治提供新的途徑。 研究材料與方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：生后72h wistar乳大鼠，雌雄不拘，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 心肌細(xì)胞的制備與培養(yǎng)：斷頸法處死乳大鼠后無菌條件下摘取左心室，D-Hank’s液洗去殘血，分離出附著組

2、織，剪成1 mm<'3>左右碎塊。采用差速貼壁法制備心肌細(xì)胞。前36h培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷0.1mmol/L抑制非心肌細(xì)胞增殖。細(xì)胞爬片后以α-肌動(dòng)蛋白免疫組化鑒定心肌細(xì)胞純度為95％以上。培養(yǎng)成活3d的心肌細(xì)胞，傳至35mm培養(yǎng)皿(含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)在2×10<'5>個(gè)左右。 實(shí)驗(yàn)一：隨機(jī)分4組：pcDNA3.1-rrBMP-7質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組)、pcDNA3.1組(空載體對(duì)照組

3、)、FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組和細(xì)胞空白對(duì)照組。pcDNA3.1(+)-rrBMP-7構(gòu)建后進(jìn)行pcDNA3.1-rrBMP-7擴(kuò)增、純化和鑒定。將含pcDNA3.1-rrBMP-7基因的質(zhì)粒2μl與FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑98μl混合，室溫下靜置30rain后將此混合物加入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，37℃、5％CO<,2>條件下培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染72h后觀察BMP-7表達(dá)情況?？蛰d體組轉(zhuǎn)染只含pcDNA3.1的質(zhì)粒；FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組細(xì)胞

4、轉(zhuǎn)染的混合物中不加質(zhì)粒，加入等量PBS；細(xì)胞空白對(duì)照組細(xì)胞不加轉(zhuǎn)染試劑，加入等量PBS。逆轉(zhuǎn)錄-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染rrBMP-7基因mRNA的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測(cè)BMP-7在心肌細(xì)胞中的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組(C組)：未經(jīng)缺血/再灌注處理；模擬缺血再灌注組(IR組)：培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧120min，復(fù)氧240min；基因轉(zhuǎn)染組(BT組)：轉(zhuǎn)染BMP-7基因后，再行缺氧120min/復(fù)

5、氧240min。每組重復(fù)8次。模擬缺血再灌注組和基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，換用95％N<,2>+5％CO<,2>混合氣體飽和30min的無糖DMEM培養(yǎng)液2ml，置于缺氧罐中缺氧培養(yǎng)2h，復(fù)制“缺血”模型。再灌注期取出培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液換用混合空氣飽和的．DMEM 2ml，放回5％二氧化碳孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。對(duì)照組細(xì)胞一直置于CO<,2>培養(yǎng)箱中，基因轉(zhuǎn)染組缺血/再灌注損傷處理前進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。心肌細(xì)胞搏動(dòng)計(jì)數(shù)和觀察形態(tài)學(xué)變化。采用臺(tái)盼

6、藍(lán)排斥法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率。應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色法和TLINEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率。測(cè)定心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)含量，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。熒光成像系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測(cè)NF-κB p65在心肌細(xì)胞核中的表達(dá)。以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB p65陽性結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)三：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，隨機(jī)分為單純?nèi)?/p>

7、血再灌注組(IR組)，心肌缺血再灌注+BMP-7治療組(B組)和假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)。各組分設(shè)缺血30mim后再灌注4h和24h時(shí)相點(diǎn)，Sham組只設(shè)4h時(shí)相點(diǎn)作總體對(duì)照；另用32只大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組和缺血再灌注+BMP-17治療組，以行TTC染色測(cè)定心肌梗死范圍。B組于再灌注前股靜脈給予rhBMP-7 250gg/kg，Sham組和IR組給予等量生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取心腔內(nèi)血檢測(cè)LDH和CPK含量，心肌勻漿檢測(cè)MDA含量

8、、SOD活性，TTC法測(cè)定心肌梗死面積，HE和電鏡下觀察心肌組織學(xué)變化。TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)NF-κB p65在心肌細(xì)胞核中的表達(dá)。 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用t檢緞驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)一：入門載體質(zhì)粒pMD 18-T Simple-BMP-7 DNA測(cè)序結(jié)果和IGene Ban

9、k中所提供的已知序列(XM342591)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，所克隆的BMP-7 cDNA從起始密碼子到終止密碼子共1293bp，與已知序列完全一致。將質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7用HindⅢ/BamHⅠ進(jìn)行酶切檢測(cè)，釋放出5406bp載體片段和1293bp BMP-7片段。RT-PCR結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)471bp條帶，表明實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中有BMP-7基因在mRNA水平的表達(dá)；空載體組、FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組和細(xì)胞空白對(duì)照組則

10、無相應(yīng)條帶出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7后，在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中有BMP-7表達(dá)，呈棕黃色。Western blot檢測(cè)到大小為18kD的特異性蛋白質(zhì)條帶。 實(shí)驗(yàn)二：模擬缺血/再灌注組(IR組)的細(xì)胞存活率降低?；蜣D(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率明顯高于缺血/再灌注組。與對(duì)照組相比，IR組搏動(dòng)頻率明顯減慢，基因轉(zhuǎn)染組搏動(dòng)頻率明顯高于IR組。對(duì)照組可見小亞二倍體峰；瓜組凋亡率明顯增加。而BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理則使細(xì)胞大部分存活

11、，凋亡率明顯低于瓜組。心肌細(xì)胞再灌注后LDH、CPK和MDA含量較正常心肌細(xì)胞顯著升高。BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理后LDH活性較IR組明顯降低。IR組SOD活性較正常對(duì)照組明顯下降，BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理后SOD活性均較IR組升高(P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定結(jié)果顯示，IR給[Ca<'2+>濃度較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理后[Ca<'2+>]含量較IR組降低(P<0.01)。IRNNF-κB p65

12、核染色和蛋白積分光密度比與正常對(duì)照組相比顯著性增高(P<0.01)。BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理后減少了NF-κBp65核染色和積分光密度比(P<0.01)。 實(shí)驗(yàn)三：心肌缺血/再灌注過程中各組MDA、SOD、LDH和CPK含量變化與Sham組相比，IR4h組和24h組的MDA、LDH和CPK含量均明顯升高，SOD活性降低(P<0.01)，表明IR組心肌組織因缺血/再灌注損傷造成氧自由基和酶學(xué)的改變。B組MDA、LDH和NCPK含量

13、與IR組相比明顯減少，與IR組比較差異有顯著性(P<0.01)；SOD較IR組明顯恢復(fù)(P<0.01)。與R組同時(shí)點(diǎn)相比，B組梗死心肌重量(IS)及其占缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量百分比(IR/AAR％)均顯著減少(P<0.01)。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，Sham組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常；IR組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重；與IR組比較，B組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷均有不同程度的改善。TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與IR組相比，B組凋亡細(xì)胞明顯減

14、少。IR組NF-κB p65核染色和積分光密度比與正常對(duì)照組相比顯著性增高(P<0.01)；BMP-7基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理后減少了NF-κB p65核染色和積分光密度比(P<0.01)。 研究結(jié)論： 1、應(yīng)用本文介紹的方法，成功地構(gòu)建了BMP-7真核表達(dá)質(zhì)粒并在心肌細(xì)胞中大量表達(dá)，為應(yīng)用于抗缺血再灌注損傷的研究創(chuàng)造了條件。 2、BMP-7轉(zhuǎn)染可對(duì)抗缺氧復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制與提高心肌細(xì)胞抗氧化損傷能力，對(duì)抗缺氧復(fù)