阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)患者介入治療的一個(gè)重要組成部分。然而，血運(yùn)重建使心肌組織遭受心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）損傷從而導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果。心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明，糖原合成酶激酶-3β（Glycog

2、en synthase kinase3 beta，GSK-3β）在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，因此，通過(guò)干預(yù)GSK-3β成為對(duì)抗心臟I/R損傷的新策略。GSK-3屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在心臟各種病理過(guò)程如心肌肥厚和缺血性損傷中發(fā)揮著重要的作用。GSK-3由兩個(gè)不同的基因編碼亞型α和β組成并廣泛表達(dá)。許多研究證實(shí)，在心臟保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮主要作用的是GSK-3β而不是GSK-3α。
　　miRNAs(microRNA)是一類(lèi)內(nèi)

3、源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸。miRNAs通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合靶messenger RNA(mRNA)，降解或阻斷靶 mRNA的翻譯。多項(xiàng)研究表明，增加miR-199a-5p表達(dá)對(duì)改善心力衰竭和心房顫動(dòng)等心臟疾病的病理生理改變有積極的促進(jìn)作用。因此，靶向干預(yù)miR-199a-5p可能成為治療I/R損傷的有效靶點(diǎn)。
　　他汀類(lèi)藥物可以預(yù)防心力衰竭、急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary s

4、yndrome，ACS），降低心血管病風(fēng)險(xiǎn)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，他汀類(lèi)藥物預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷，然而，他汀類(lèi)藥物心臟保護(hù)作用的重要分子機(jī)制尚未完全闡明。因此我們推測(cè)，他汀類(lèi)藥物可能通過(guò)miR-199a-5p/GSK-3β通路抑制細(xì)胞凋亡從而起到的心肌 I/R損傷的保護(hù)作用。
　　本研究通過(guò)建立心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）模型模

5、擬心肌I/R損傷,檢測(cè)GSK-3βmRNA和蛋白表達(dá)水平的變化以驗(yàn)證阿托伐他汀（atorvastatin，Ator）對(duì)H9c2心肌細(xì)胞和新生大鼠原代心肌細(xì)胞的作用。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)了阿托伐他汀對(duì)miR-199a-5p表達(dá)的調(diào)控以及miR-199a-5p對(duì)GSK-3β基因表達(dá)的干預(yù)。于是我們進(jìn)一步分析阿托伐他汀對(duì)心肌I/R損傷的作用機(jī)制，為心肌I/R損傷的預(yù)防和臨床治療提供了理論依據(jù)和新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　第一部分阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)

6、大鼠原代心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　目的：探討阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用，以及阿托伐他汀是否通過(guò)靶向GSK-3β發(fā)揮心肌保護(hù)的作用。
　　方法：
　　選擇出生1~3天的 SD大鼠，通過(guò)氧糖剝奪再灌注損傷模型模擬心肌缺血再灌注損傷，給予心肌細(xì)胞氧糖剝奪6 h，再灌注1h處理。
　　實(shí)驗(yàn)分組：
　　1) control組：使用含10％ FBS的DME

7、M高糖培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞。
　　2) OGD/R組：氧糖剝奪6 h，再灌注1h。
　　3) Ator+OGD/R組：在進(jìn)行 OGD/R前，更換 Ator濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞3h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行氧糖剝奪再灌注。
　　4) LiCl+Ator+OGD/R組：使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1h，用PBS清洗細(xì)胞，更換Ator濃度為1μM的

8、DMEM預(yù)處理細(xì)胞3h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行氧糖剝奪再灌注。
　　5) LiCl+OGD/R組：使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行氧糖剝奪再灌注。
　　心肌細(xì)胞缺血再灌注后，通過(guò)MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）含量判斷細(xì)胞損傷情況，通過(guò) Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及GSK-3β蛋白表達(dá)。利用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)GSK-3β mRNA和m

9、iR-199a-5p表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 Ator預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞 GSK-3β蛋白和mRNA表達(dá)的影響。
　　Western blot法檢測(cè)GSK-3β蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯下降，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組GSK-3β蛋白表達(dá)水平較 OGD/R組顯著升高（P＜0.05）。
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法，以β-ac

10、tin作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞GSK-3β mRNA表達(dá)水平明顯下降，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組GSK-3βmRNA表達(dá)水平較 OGD/R組顯著升高（P＜0.05）。
　　2預(yù)處理Ator對(duì)原代心肌細(xì)胞活力的影響
　　通過(guò) MTS測(cè)定心肌細(xì)胞活力，心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注可導(dǎo)致明顯的心肌細(xì)胞活力下降。與 OGD/R組相比，Ator預(yù)處理組明顯增加了

11、心肌細(xì)胞活力（P＜0.05）。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預(yù)處理細(xì)胞組，LiCl取消了 Ator對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用（P＜0.05）。與 OGD/R組相比較，加入 LiCl后再進(jìn)行氧糖剝奪再灌注對(duì)心肌細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　3預(yù)處理Ator對(duì)原代心肌細(xì)胞 LDH的影響
　　檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH含量，與 control組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯，兩者具有

12、顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組LDH水平較 OGD/R組降低顯著（P＜0.05）。加入LiCl和Ator共同預(yù)處理細(xì)胞組， LiCl取消了 Ator預(yù)處理降低LDH水平的作用（P＜0.05）。與 OGD/R組相比較，單獨(dú)給予 LiCl對(duì)心肌細(xì)胞LDH釋放無(wú)明顯影響（P＞0.05）
　　4 Ator預(yù)處理對(duì)原代心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase9、B細(xì)胞淋巴因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、細(xì)

13、胞色素C(Cytochrome C，Cyto C)的影響。
　　Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，與 control組相比， OGD/R組心肌細(xì)胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)明顯上升， Ator預(yù)處理組 Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)較 OGD/R組減少（P＜0.05）。與Ator預(yù)處理組相比， LiCl+Ator組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)升高（P＜0.05

14、）。說(shuō)明LiCl抵消了Ator預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞OGD/R的保護(hù)作用。
　　5 Ator預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)的影響。
　　miR-199a-5p在心肌細(xì)胞OGD/R損傷后以及Ator預(yù)處理后的損傷中表達(dá)變化明顯，為了研究miR-199a-5p在 Ator的心肌保護(hù)中的作用，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)

15、水平明顯上升，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組miR-199a-5p表達(dá)水平較 OGD/R組降低顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 Ator預(yù)處理減輕心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷。
　　2 Ator預(yù)處理通過(guò)上調(diào)GSK-3β起到心肌細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用。
　　3 miR-199a-5p在心肌細(xì)胞OGD/R后表達(dá)升高，而在Ator預(yù)處理的OGD/R后表達(dá)下降，可進(jìn)一步研究miR-1

16、99a-5p在Ator預(yù)處理減輕心肌細(xì)胞OGD/R損傷中的作用。
　　第二部分阿托伐他汀預(yù)處理通過(guò)上調(diào)GSK-3β減輕H9C2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷
　　目的：探討阿托伐他汀預(yù)處理是否通過(guò)調(diào)節(jié)GSK-3β對(duì)H9C2心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷起到保護(hù)作用，以及 miR-199a-5p在 Ator預(yù)處理減輕H9C2細(xì)胞OGD/R損傷中的作用。
　　方法：
　　使用大鼠H9C2心肌細(xì)胞系傳代培養(yǎng)，通過(guò)氧糖剝奪再灌注損傷

17、模型模擬心肌缺血再灌注損傷，經(jīng)歷氧糖剝奪6 h，再灌注1h處理。
　　實(shí)驗(yàn)分組：
　　1) control組：使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞。
　　2) OGD/R組：氧糖剝奪6 h，再灌注1h。
　　3) Ator+OGD/R組：在進(jìn)行OGD/R前，更換Ator濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞3h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行OGD/R。
　　

18、4) LiCl+Ator+OGD/R組：使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1h，用PBS清洗細(xì)胞，更換Ator濃度為1μM的DMEM預(yù)處理細(xì)胞3h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行OGD/R。
　　5) LiCl+OGD/R組：使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1h，用PBS清洗細(xì)胞，然后進(jìn)行OGD/R。
　　H9C2細(xì)胞缺血再灌注后，通過(guò) MTS檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）含量判斷細(xì)

19、胞損傷情況，通過(guò)Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及GSK-3β蛋白表達(dá)。利用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)GSK-3βmRNA和miR-199a-5p表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 Ator預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞 GSK-3β蛋白和mRNA表達(dá)的影響。
　　通過(guò)Western blot法檢測(cè)GSK-3β蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯下降，兩者具有顯著性

20、差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組GSK-3β蛋白表達(dá)水平較 OGD/R組顯著升高（P＜0.05）。
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞GSK-3β mRNA表達(dá)水平明顯下降，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組GSK-3βmRNA表達(dá)水平較 OGD/R組顯著升高（P＜0.05）。
　　2 Ator預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)

21、胞活力的影響
　　通過(guò) MTS測(cè)定H9C2細(xì)胞活力，H9C2細(xì)胞OGD/R可導(dǎo)致細(xì)胞活力明顯下降。與 OGD/R組相比，Ator預(yù)處理組明顯增加了 H9C2細(xì)胞活力（P＜0.05）。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預(yù)處理細(xì)胞組， LiCl取消了Ator對(duì)H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用（P＜0.05）。與 OGD/R組相比較，加入 LiCl后再進(jìn)行氧糖剝奪再灌注對(duì)H9C2細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　3 At

22、or預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞 LDH的影響
　　檢測(cè)H9C2細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH含量，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組 LDH水平較 OGD/R組降低顯著（P＜0.05）。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預(yù)處理細(xì)胞組，LiCl取消了 Ator預(yù)處理降低 LDH水平的作用（P＜0.05）。與 OGD/R組相比較，單獨(dú)給予 L

23、iCl對(duì)H9C2細(xì)胞LDH釋放無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　4 Ator預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase9、Bcl-2、Cyto C的影響。
　　Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)明顯上升（P＜0.05）， Ator預(yù)處理組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)較 OGD/R組減少。與A

24、tor預(yù)處理組相比， LiCl+Ator組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)升高（P＜0.05）。說(shuō)明LiCl抵消了Ator預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞OGD/R的保護(hù)作用。
　　5 Ator預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)的影響。
　　miR-199a-5p在H9C2細(xì)胞OGD/R損傷后表達(dá)增高，而在Ator預(yù)處理后的損傷中表達(dá)減少。為了研究miR-199a-5p在 Ator的心肌保護(hù)中的作用，應(yīng)用實(shí)時(shí)定

25、量 PCR方法，以 U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)水平明顯上升，兩者具有顯著性差異（ P＜0.05）。Ator預(yù)處理組miR-199a-5p表達(dá)水平較 OGD/R組降低顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 Ator預(yù)處理減輕H9C2細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷。
　　2 Ator預(yù)處理通過(guò)上調(diào)GSK-3β起到H9C2細(xì)胞OGD/R損傷的保

26、護(hù)作用。
　　3 OGD/R組miR-199a-5p高表達(dá)GSK-3β低表達(dá)，而在Ator預(yù)處理組 miR-199a-5p低表達(dá) GSK-3β高表達(dá)，可進(jìn)一步研究 miR-199a-5p對(duì)GSK-3β是否存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以及 miR-199a-5p在 Ator預(yù)處理減輕H9C2細(xì)胞OGD/R損傷中的作用。
　　第三部分阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用通過(guò)抑制miR-199a-5p
　　目的：探討 miR-

27、199a-5p與 GSK-3β之間的相互作用關(guān)系以及miR-199a-5p在Ator預(yù)處理減輕H9C2細(xì)胞OGD/R損傷中的作用。
　　方法：
　　采用大鼠 H9C2心肌細(xì)胞，使用20 nM濃度 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h。
　　實(shí)驗(yàn)分組
　　1) control組：使用無(wú) FBS無(wú)雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h的H9C2細(xì)胞。
　　2) OG

28、D/R組：氧糖剝奪6 h，再灌注1h。
　　3) miR-199a-5p inhibitor+ OGD/R組：在進(jìn)行 OGD/R前，經(jīng)過(guò)miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24h，然后進(jìn)行氧糖剝奪再灌注。
　　4) miR-199a-5p inhibitor組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò) miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24h后，恢復(fù)正常培養(yǎng)。
　　使用RT-PCR法確認(rèn)miRNA轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)MTS

29、檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）含量判斷細(xì)胞損傷情況，通過(guò)Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及 GSK-3β蛋白表達(dá)。利用實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè)GSK-3β mRNA和 miR-199a-5p表達(dá)。采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè) GSK-3β蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
　　通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)miR-199a-5p的表達(dá)，以確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。相對(duì)于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-199

30、a-5p mimic可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)明顯上升，兩者具有顯著性差異（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)明顯下降，兩者具有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　2細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)基因表達(dá)的影響
　　2.1轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic和miR-199a-5p inhibitor對(duì)GSK-3β mRNA水平的

31、影響
　　相對(duì)于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中GSK-3β mRNA的表達(dá)明顯下降，兩者具有顯著性差異（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中GSK-3βmRNA的表達(dá)明顯上升，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　2.2轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic和miR-199a-5p inhibitor對(duì)GSK-3β蛋白水平

32、的影響
　　轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic后H9C2細(xì)胞中GSK-3β蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05），轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p inhibitor后 H9C2細(xì)胞中GSK-3β蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上升（P＜0.05）。提示miR-199a-5p對(duì)GSK-3β存在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，抑制miR-199a-5p表達(dá)，可恢復(fù)GSK-3β活性。
　　3 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)

33、H9C2細(xì)胞活力的影響
　　通過(guò) MTS測(cè)定H9C2細(xì)胞活力，將各組的結(jié)果與control組相比較，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。H9C2細(xì)胞氧糖剝奪再灌注可導(dǎo)致明顯的H9C2細(xì)胞活力下降。與OGD/R組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進(jìn)行OGD/R組，細(xì)胞活力明顯增加（P＜0.05）。單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor細(xì)胞活性無(wú)明顯變化。
　　4 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)H

34、9C2細(xì)胞 LDH的影響
　　檢測(cè)H9C2細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH含量，將各組的結(jié)果與control組相比較，OGD/R處理后培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯，兩者具有顯著性差異（P＜0.05）。與OGD/R組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進(jìn)行OGD/R組培養(yǎng)基中LDH水平明顯降低（P＜0.05）。單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor對(duì) LDH無(wú)明顯影響。
　　5 miR-199a-5p in

35、hibitor轉(zhuǎn)染對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase9、Bcl-2和Cyto C的影響。
　　Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，與 control組相比， OGD/R組H9C2細(xì)胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)明顯上升（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進(jìn)行OGD/R組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達(dá)較 OGD/R組減少（P＜0.05）。

36、　　6 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)H9C2細(xì)胞 GSK-3β蛋白表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分已證實(shí)，GSK-3β在心肌缺血再灌注損傷中起到至關(guān)重要的心肌保護(hù)作用，為了研究miR-199a-5p在OGD/R過(guò)程中如何靶向調(diào)節(jié)GSK-3β，我們通過(guò)Western blot法檢測(cè)GSK-3β蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組H9C2細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯下降，兩者具有顯著性差異（

37、P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進(jìn)行OGD/R組GSK-3β蛋白表達(dá)水平較 OGD/R組顯著升高（P＜0.05）；單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor使GSK-3β蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。
　　免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，與 control組相比，OGD/R組GSK-3β熒光明顯減弱；轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進(jìn)行OGD/R組GSK-3β熒光表達(dá)較 OGD/

38、R組增強(qiáng)；單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor使GSK-3β熒光表達(dá)增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1 miR-199a-5p調(diào)控 GSK-3β轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)， GSK-3β是miR-199a-5p的靶基因。
　　2抑制miR-199a-5p表達(dá)可以對(duì)抗H9C2細(xì)胞OGD/R損傷。
　　3抑制 miR-199a-5p通過(guò)上調(diào)靶基因 GSK-3β對(duì)抗 H9C2細(xì)胞OGD/R損傷。
　　4 Ator預(yù)處