缺血再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制——Homer1a和QKI的作用.pdf

1、心肌梗死是人類的頭號(hào)殺手，目前通過溶栓或者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)（PCI）等方法快速有效的恢復(fù)冠脈血流是減輕心肌損傷的最佳策略。然而，這種心肌再灌注自身亦可以引起心肌損傷，可能導(dǎo)致了最終梗死面積的50％，這種損傷被稱為心肌再灌注損傷。心肌再灌注損傷是一種多種分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與，損傷機(jī)制與保護(hù)機(jī)制相互競(jìng)爭(zhēng)的復(fù)雜過程。因此，找到導(dǎo)致或者抑制心肌缺血/再灌注損傷的重要分子能夠幫助我們?cè)诨A(chǔ)研究或者臨床應(yīng)用中最大程度的利用心肌再灌注的有益作

2、用。本研究選擇兩個(gè)在心肌中也大量表達(dá)，但在心肌中功能尚不清楚的兩個(gè)分子（Homer1a蛋白和QKI蛋白），試圖探明其在心肌再灌注損傷中的表達(dá)變化及意義。
　　研究一、Homer1腳架蛋白Homer在腦、心臟和骨骼肌，腎臟等組織表達(dá)。已有研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)，所有Homer蛋白都通過其N-末端EVH1域與其他含有脯氨酸富集的基序（PPxxFr）的分子相互作用。所有長(zhǎng)Homer亞型可以通過C-末端循環(huán)域含有亮氨酸拉鏈基序與同族或其他

3、Homer家庭成員形成同源、異源二聚體。由于其獨(dú)特的二聚性能，長(zhǎng)型的Homer作為支架蛋白調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路；與此相反，短型的Homer，如Homer1a，缺乏二聚體形成結(jié)構(gòu)域，常抑制長(zhǎng)型行使的功能。神經(jīng)系統(tǒng)的研究表明，ERK的激活依賴于Homer1b/c，而Homer1a可以干擾ERK激活。ERK在心肌中可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，在再灌注過程中發(fā)揮一種心肌保護(hù)效應(yīng)。本研究試圖觀察Homer1各亞型在心肌缺血/再灌注中的表達(dá)模式，探明其對(duì)缺血

4、再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　　1.離體和在體實(shí)驗(yàn)都證明缺血/再灌注可以誘導(dǎo)Homer1a上調(diào)
　　我們采用商業(yè)抗體檢測(cè)了新生大鼠心肌細(xì)胞、H9C2細(xì)胞中Homer1各亞型的表達(dá)情況。神經(jīng)系統(tǒng)中，Homer1a只有在神經(jīng)元活動(dòng)或者受到刺激時(shí)才表達(dá)。而在我們的觀察中，正常心肌細(xì)胞可以表達(dá)Homer1a和1b/c，與神經(jīng)系統(tǒng)略有不同。在培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和胚心來源的成肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞中采用培

5、養(yǎng)基和氧氣同時(shí)撤除的方式模擬細(xì)胞缺血,Homer1a都被缺血/再灌注大量誘導(dǎo)表達(dá)。與Homer1a不同，Homer1b/c在以上處理中均保持穩(wěn)定。
　　2.沉默Homer1a增加H9C2的凋亡敏感性
　　為了評(píng)價(jià)Homer1a在缺血/再灌注條件下上調(diào)的意義，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)Homer1a的siRNA以敲除Homer1a的表達(dá)。敲除之后的細(xì)胞再給予9hr缺血和6hr再灌注處理，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照RNA的

6、細(xì)胞凋亡率為43.6±3.4％，而轉(zhuǎn)染了siRNA的細(xì)胞凋亡率為21.2±3.3％，顯著低于ncRNA組（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)提示IR時(shí)Homer1a的上調(diào)促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.過表達(dá)Homer1a增加乳鼠心肌細(xì)胞凋亡易感性
　　為了確認(rèn)Homer1a是否促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，我們構(gòu)建了表達(dá)Homer1a的腺病毒。采用對(duì)照病毒（Ad-RFP）或者Homer1a病毒（Ad-H1a）感染心肌細(xì)胞，然后再給予4hr缺血和6

7、hr再灌注處理，采用AnnexinV單染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，未經(jīng)處理的細(xì)胞由于對(duì)胰酶的敏感，也產(chǎn)生了3.8±0.8％的凋亡；感染Ad-RFP的細(xì)胞受到上述I4R6處理之后凋亡率為31.7±4.5％；而感染Ad-Homer的細(xì)胞經(jīng)I4R6處理之后凋亡率為52.8±2.3％，顯著高于Ad-RFP組。
　　4.沉默Homer1a增加H9C2細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的ERK1/2激活
　　ERK1/2是一種具有心肌保護(hù)作用的激酶，過表達(dá)組

8、成性活化的MEK1/2（ERK1/2上游激酶）可以縮小IR引起的心肌梗死范圍。沉默Homer1a之后，4hr缺血加6小時(shí)再灌注都不能誘導(dǎo)Homer1a增高。4hr缺血和20min再灌注之后，ERK1/2被激活，而在Homer1a沉默的細(xì)胞中，ERK1/2激活的程度更加顯著。
　　5.過表達(dá)Homer1a抑制IR過程中ERK1/2的激活
　　為了檢驗(yàn)Homer1a對(duì)心肌中ERK1/2的激活是否有抑制作用，腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞

9、后給予4hr缺血加20min再灌注。我們發(fā)現(xiàn)，IR在對(duì)照病毒感染的細(xì)胞中誘導(dǎo)了ERK1/2的顯著激活；而采用腺病毒感染過表達(dá)Homer1a不僅可以抑制ERK1/2的本底磷酸化水平，還可以抑制IR誘導(dǎo)的ERK1/2激活。
　　總之，以上研究首次發(fā)現(xiàn)IR可以誘導(dǎo)Homer1a表達(dá)上調(diào)，這種上調(diào)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，可能的機(jī)制為Homer1a的上調(diào)抑制了心肌保護(hù)激酶ERK1/2的充分激活。
　　研究二、QKI蛋白QKI屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和R

10、NA激活（STAR）家族蛋白，包括QKI-5、-6、-7三種異構(gòu)體，qkI的初始轉(zhuǎn)錄本C末端外顯子選擇性剪接后表達(dá)。每一種QKI異構(gòu)體都含有KHRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。QKI蛋白在腦和心臟大量表達(dá)并通過調(diào)節(jié)mRNA代謝發(fā)揮作用。QKI在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究，證明其可以通過調(diào)控參與髓鞘生成過程中相關(guān)mRNA的穩(wěn)態(tài)而參與髓鞘生成，QKI缺乏可以導(dǎo)致髓鞘生成障礙。由于QKI蛋白通過特異結(jié)合其靶mRNA的3’UTR起作用，通過生物信息學(xué)分

11、析，有很多mRNA可能是QKI蛋白的靶分子，其中促凋亡蛋白Foxo1mRNA的3’UTR有3個(gè)QKI保守結(jié)合位點(diǎn)。因此我們致力于研究QKI蛋白在心肌細(xì)胞凋亡中的作用，并試圖探明其與FOXO1之間的調(diào)控關(guān)系。主要結(jié)果如下：
　　1.缺血/再灌注抑制QKI-5表達(dá)
　　我們采用一個(gè)能夠檢測(cè)所有QKI亞型的抗體檢測(cè)了乳鼠心肌細(xì)胞、H9C2細(xì)胞和成年大鼠心肌中的QKI表達(dá)。采用westernblotting方法檢測(cè)到了40kDa和3

12、8kDa兩條帶，按照分子量這兩條帶應(yīng)該是QKI5和QKI6。另外采用間接免疫熒光方法檢測(cè)了QKI的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中QKI主要表達(dá)于細(xì)胞核，在胞漿中也可淡染。已有證據(jù)表明QKI5存在于細(xì)胞核，QKI6存在于胞漿和胞核，QKI7只存在于胞漿，故以上的數(shù)據(jù)提示心肌細(xì)胞中主要表達(dá)QKI5和QKI6。在NCM和H9C2細(xì)胞中，單純培養(yǎng)基撤除可以抑制QKI5的表達(dá)，徹底缺血（培養(yǎng)基和氧供都撤除）進(jìn)一步抑制QKI5表達(dá)，而缺血再灌注可以將Q

13、KI5的表達(dá)幾乎清除。這些現(xiàn)象在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。與之不同的是，QKI6在這些處理中都沒有發(fā)生明顯改變。整體動(dòng)物缺血/再灌注模型中，QKI5和QKI6都發(fā)生了表達(dá)下降，可能是由于心肌組織中細(xì)胞成分過多的原因。
　　2.沉默QKI表達(dá)增加H9C2細(xì)胞凋亡易感性
　　為了評(píng)價(jià)IR條件下QKI表達(dá)下降的意義，我們?cè)贖9C2細(xì)胞中采用RNA干涉沉默QKI表達(dá)。然后轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照RNA（ncRNA）或者siRNA的細(xì)胞再用9

14、hr缺血加6小時(shí)再灌注處理。陰性對(duì)照未經(jīng)任何處理，凋亡率為1.8±0.6；感染ncRNA細(xì)胞凋亡率為33.2±2.4％，QKI干涉后細(xì)胞凋亡率為54.9±3.5％，顯著高于ncRNA組（P<0.01,圖2.2.2）。
　　3.過表達(dá)QKI5或者QKI6抑制IR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　乳鼠心肌細(xì)胞感染對(duì)照或者QKI5、6病毒，然后給與4hr缺血加6hr再灌注處理，采用AnnexinV和PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。4.9±1

15、.6％的細(xì)胞凋亡；Ad-CMV組細(xì)胞凋亡率為34.0±2.3％，Ad-QKI6組為14.7±2.2％，另外，PARP實(shí)驗(yàn)還證實(shí)Ad-QKI5組凋亡顯著低于Ad-EGFP組。
　　4.沉默QKI增加IR條件下FOXO1的表達(dá)
　　在不給予IR處理時(shí)，F(xiàn)OXO1表達(dá)量很低，沉默IR并沒有影響FOXO1的表達(dá)，可見QKI的降低不是FOXO1升高的誘導(dǎo)因素。ncRNA組細(xì)胞中，IR可以使FOXO1表達(dá)顯著升高；而在siRNA組細(xì)胞中

16、，IR誘導(dǎo)的FOXO1增高更加顯著。因此我們推測(cè)，IR過程中的其他因素誘導(dǎo)了FOXO1的表達(dá)，而QKI的降低導(dǎo)致了FOXO1表達(dá)的失控。為了證明QKI對(duì)FOXO具有負(fù)性調(diào)控作用，我們做了以下實(shí)驗(yàn)。
　　5.過表達(dá)QKI5或者QKI6下調(diào)FOXO1表達(dá)水平，并促其出核
　　在正常情況下，F(xiàn)OXO1表達(dá)水平很低，過表達(dá)QKI并沒有影響其表達(dá)。IR誘導(dǎo)FOXO1大量表達(dá)，而過表達(dá)QKI5或者QKI6之后，將FOXO1的表達(dá)抑制到本

17、底水平。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)也表明，QKI5或者QKI6過表達(dá)能夠?qū)⒓?xì)胞核中的FOXO1表達(dá)抑制到原始水平。胞漿中仍然能夠觀察到FOXO1表達(dá)，與未處理時(shí)水平相近。
　　總之，本研究首次提供證據(jù)證明QKI5和QKI6蛋白具有很強(qiáng)的抗缺血、再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡的作用，這種作用可能通過抑制促凋亡轉(zhuǎn)錄因子FOXO1產(chǎn)生。另外，本研究還提示，在模擬缺血/再灌注時(shí)QKI5的降低導(dǎo)致了對(duì)促凋亡轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達(dá)失去控制，最終（至少是部分）