硫化氫對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分急性心肌缺血大鼠心肌glycogen synthase kinase-3β/β-catenin信號(hào)通路蛋白的變化
　　目的：觀察大鼠急性心肌缺血過(guò)程中心肌組織 GSK-3β及β-catenin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　方法：
　　1健康雄性SD大鼠（270±20g）40只，隨機(jī)分成5組：①假手術(shù)組；②缺血2h組；③缺血3h組；④缺血6h組；⑤缺血9h組。通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）建立急性心肌缺血模型

2、。大鼠麻醉后連接心電圖，記錄術(shù)前II導(dǎo)聯(lián)心電圖，消毒手術(shù)區(qū)域，術(shù)后2min再次記錄心電圖的變化，以S-T段較術(shù)前抬高0.15mv以上作為造模成功。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。
　　2缺血組分別于缺血后2h、3h、6h和9h用Powerlab8/s多通道生理記錄儀記錄各組大鼠的平均動(dòng)脈壓（MAP）、左室發(fā)展壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力變化速率（dp/dtmax，dp/dtmin）。
　　3取血分離血清，測(cè)

3、定乳酸脫氫酶（LDH）活性。
　　4取心臟，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。
　　5蛋白免疫印跡法（ Western blot）檢測(cè) p-GSK-3β、t-GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1與假手術(shù)組大鼠比較，心肌缺血3h、6h、9h時(shí)，MAP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin均明顯降低（P<0.01），LVEDP顯著升高（P<0.01）；2與假手術(shù)組大鼠比較，心肌缺血3h、6h、

4、9h血清中 LDH活性均顯著升高（P<0.01）；3假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻。心肌缺血6h及缺血9h組大鼠心臟部分區(qū)域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎癥因子滲出；4各組大鼠心肌組織中t-GSK-3β的表達(dá)無(wú)顯著變化，與假手術(shù)組大鼠比較，缺血3h、6h、9h組大鼠心肌p-GSK-3β、p-GSK-3β/t-GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。
　　第二部分硫化氫通過(guò)g

5、lycogen synthase kinase-3β/β-catenin信號(hào)途徑介導(dǎo)心肌損傷后抗細(xì)胞凋亡作用
　　目的：觀察硫化氫外源性供體硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaHS）對(duì)大鼠急性心肌缺血組織細(xì)胞凋亡的影響，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1健康雄性SD大鼠（270±20g）56只，隨機(jī)分成7組：①假手術(shù)組；②心肌缺血組；③心肌缺血+NaHS低劑量（0.78mg/kg，i.p.）組

6、；④心肌缺血+NaHS中劑量（1.56mg/kg， i.p.）組；⑤心肌缺血+NaHS高劑量（3.12mg/kg，i.p.）組；⑥心肌缺血+SB216763（0.6mg/kg，i.v.）組；⑦心肌缺血+溶劑對(duì)照（1％DMSO，2ml/kg，i.v.）組。各組大鼠均于缺血3h給藥，術(shù)后6h處死并取材。通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性心肌缺血模型。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。
　　2用 Powerlab8/s多通道生理記錄儀記錄各組

7、大鼠平均動(dòng)脈壓（MAP）、左室發(fā)展壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力變化速率（dp/dtmax，dp/dtmin）。
　　3取血分離血清，測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）活性。
　　4取心臟，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。
　　5 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。
　　6 Western blot檢測(cè)p-GSK-3β、t-GSK-3β、β-catenin、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)

8、法（IHC）測(cè)定β-catenin、Bax和Bcl-2表達(dá)。
　　結(jié)果：1與假手術(shù)組大鼠比較，心肌缺血組大鼠MAP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin均顯著降低（P<0.01），LVEDP顯著升高（P<0.01）。與心肌缺血組大鼠比較，心肌缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠MAP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin均顯著升高（P<0.05或P<0.01），LVEDP顯著降低（P<0.01）；2與假手術(shù)組大鼠比較

9、，心肌缺血組大鼠血清LDH活性顯著升高（P<0.01）。與心肌缺血組比較，心肌缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠血清LDH活性顯著降低（P<0.05或P<0.01）；3 HE染色光鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化：假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻。心肌缺血組大鼠部分區(qū)域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎性因子滲出，心肌缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠也有心肌細(xì)胞變性的改變，但程度較缺血組輕；4與假手術(shù)組大鼠比較，心肌缺血組

10、大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與心肌缺血組大鼠比較，心肌缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或 P<0.01），Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（ P<0.05或 P<0.01）；5與假手術(shù)組大鼠比較，心肌缺血組p-GSK-3β、p-GSK-3β/t-GSK-3β、β-catenin表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與

11、心肌缺血組大鼠比較，心肌缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌p-GSK-3β、p-GSK-3β/t-GSK-3β、β-catenin表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或 P<0.01）；6與心肌缺血+溶劑對(duì)照組大鼠比較，心肌缺血+SB組大鼠心肌組織中p-GSK-3β與β-catenin表達(dá)均顯著增加（P<0.01），此外心肌缺血+SB組大鼠可顯著升高M(jìn)AP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin（P<0.01），降低LVEDP（P