硫化氫對大鼠急性心肌缺血的影響.pdf

1、心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)，嚴重威脅人類的身心健康，因而對于缺血心肌保護的研究是倍受關注的課題。大量動物實驗及臨床試驗均表明，細胞凋亡是急性心肌缺血損傷發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)之一，線粒體在細胞整合各種凋亡刺激信號的過程中處于樞紐地位。
　　 作為繼一氧化氮(nitricoxide，NO)和一氧化碳(carbonmonoxide，CO)之后的第三種重要化學

2、遞質(zhì)和細胞內(nèi)信號分子--硫化氫(hydrogensulfide，H2S)一直倍受醫(yī)學界的關注。內(nèi)源性H2S主要由半胱氨酸等含硫氨基酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)作用下生成的，人們對其在體內(nèi)各種生理和病理過程的調(diào)節(jié)作用進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)其在舒張血管、抑制血管重構和保護心肌等方面具有重要的生理作用，并且與多種心血管

3、疾病相關。近年來研究發(fā)現(xiàn)，H2S在心肌缺血再灌注損傷中起著十分重要的作用，對缺血再灌注損傷心肌具有保護作用，但關于H2S在心肌缺血中的作用，尚未見報道。因此，本實驗通過建立心肌缺血動物模型，首先觀察在心肌缺血過程中H2S和CSE的時程性變化，在此基礎上給予H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)，觀察其對心肌損傷的改善作用，并探討其心肌保護作用機制，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分急性心肌

4、缺血大鼠內(nèi)源性硫化氫/胱硫醚-γ-裂解酶體系的變化
　　 目的：觀察大鼠急性心肌缺血過程中不同時間內(nèi)源性H2S/CSE體系的變化。
　　 方法：健康雄性SD大鼠(270±20g)共80只，隨機分為6組①假物術組；②缺血1h組；③缺血3h組；④缺血6h組；⑤缺血9h組；⑥缺血12h組，假手術組共40只（不同時間點各8只）。大鼠麻醉后連接心電圖電極，記錄術前Ⅱ?qū)?lián)心電圖，消毒手術區(qū)域，結(jié)扎左冠狀動脈前降支2分鐘后再次記錄心電

5、圖的變化，以S-T段較術前抬高0.15mv以上作為模型成功，假手術組只穿線不結(jié)扎。分別于1h、3h、6h、9h和12h后Powerlab/8s多導生理儀記錄各組大鼠缺血末左室收縮峰壓(LVSP)，左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力變化速率（±dp/dtmax）、計算左室發(fā)展壓(LVDP)，經(jīng)頸總動脈取血并迅速開胸取心臟，采用去蛋白法檢測血漿中H2S含量，亞甲基監(jiān)法檢測心肌組織中CSE的活性，電鏡觀察心肌組織結(jié)構的變化。
　　

6、結(jié)果：
　　 1、假手術組大鼠LVEDP、±dp/dtma、LVDP在缺血后1h～12h之間無明顯變化。與相應的假手術組比較，缺血1h時大鼠上述各項指標均無明顯變化，缺血3h時±dp/dtmax、LVDP明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，LVEDP明顯升高（P＜0.01），隨著時間的延長，缺血6h、9h和12h時LⅥ）P、±dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 2、假手

7、術組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性在缺血后1h～12h之間無明顯變化。與相應的假手術組比較，缺血1h時大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性無明顯變化，隨著時間的延長，缺血3h、6h、9h和12h大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3、電鏡下觀察心肌組織的超微結(jié)構，假手術組大鼠心肌細胞結(jié)構清晰，肌原纖維排列整齊，線粒體膜完整，嵴清晰。缺血1h組大鼠心肌組織的超微結(jié)

8、構基本正常。缺血3h、6h、9h和12h組大鼠心肌組織超微結(jié)構明顯受損，核周胞質(zhì)有水腫，核膜消失，肌原纖維斷裂，線粒體嵴和膜溶解、消失，胞漿內(nèi)糖原包涵體增多，提示代謝障礙。甚至有的線粒體髓樣化，呈同心圓排列，電子密度增高。
　　 結(jié)論：大鼠缺血1h時心肌組織未出現(xiàn)明顯損傷，缺血3h至12h時均存在組織損傷，內(nèi)源性H2S含量和CSE活性均明顯降低。提示H2S/CSE體系可能參與急性心肌缺血的病理生理過程。
　　 第二部分硫

9、化氫對心肌缺血大鼠線粒體功能及細胞凋亡的影響
　　 目的：觀察H2S對大鼠急性心肌缺血的影響并從線粒體功能及細胞凋亡方面探討其作用機制。
　　 方法：健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共40只，隨機分為5組，每組8只，分別為Ⅰ假手術組；Ⅱ缺血組；Ⅲ缺血+NaHS低劑量組；Ⅳ缺血+NaHS中劑量組；V缺血+NaHS高劑量組。用10％的水合氯醛350mg/kg麻醉大鼠，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，記錄心電圖的變化，NaHS低、

10、中、高劑量組分別于缺血3h時腹腔注射0.78mg/kg、1.56mg/kg和3.12mg/kg的NaHS，缺血組注射等容量的生理鹽水，假手術組只穿線不結(jié)扎。各組大鼠均于缺血6h時經(jīng)頸總動脈取血迅速開胸取心臟，采用去蛋白的方法檢測血漿中H2S含量，亞甲基藍法檢測心肌組織中CSE的活性，差速離心法提取心肌線粒體，測定線粒體活性、膜腫脹度，以及線粒體總ATP酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量

11、，流式細胞術(FCM)檢測心肌細胞凋亡率，免疫組化法測定Bcl-2、Bax蛋白的表達，HE染色觀察心肌組織學變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、與假手術組大鼠比較，缺血組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織中CSE活性明顯降低（P＜0.05）。與缺血組大鼠比較，缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織中CSE活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2、與假手術組大鼠比較，缺血組大鼠心肌線粒體

12、總ATP酶、GSH-Px活性、SOD活性明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)，心肌線粒體膜腫脹、線粒體活力下降，表現(xiàn)為540nm和570nm處吸光度值下降(P＜0.01)，與缺血組比較，缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌線粒體總ATP酶、GSH-Px活性、SOD活性升高，MDA含量降低，心肌線粒體膜腫脹、線粒體活力明顯改善(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3、與假手術組大鼠比較，缺血組大鼠心肌細

13、胞凋亡率、Bax表達陽性細胞數(shù)百分率明顯升高(P＜0.01)，缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率、Bax表達陽性細胞數(shù)百分率明顯低于缺血組，Bcl-2表達陽性細胞數(shù)百分率明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 4、HE染色光鏡觀察心肌組織形態(tài)學變化：假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，著色均勻。缺血組大鼠部分區(qū)域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎性因子滲出，NaHS低、中、高劑量組大鼠也有心肌細胞變