硫化氫對腦缺血再灌注后炎癥的影響.pdf

1、目的:硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是有著“一種臭雞蛋氣味的氣體”，長期接觸這種有害氣體，將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)等許多組織器官的損害。但是有大量資料證明，H2S不只有毒性作用，而且還廣泛參與機(jī)體多種生理及病理的過程，被認(rèn)為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三類氣體信號分子。正常動(dòng)物體內(nèi)可以合成H2S，參與內(nèi)源性H2S合成的兩種重要的酶是胱硫醚β-合酶(cystathionine beta-s

2、ynthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ lyase，CSE)。其中CBS主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而CSE則主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織。近幾年的研究表明，H2S可以通過抗氧化、抑制凋亡等發(fā)揮抗腦、心肌、肝及腎等多器官組織缺血再灌注損傷作用。炎癥在腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)大鼠模型，通過腹腔給藥的方式，研究不同劑量硫化氫供體Na

3、HS及H2S合成酶抑制劑羥氨(hydroxylamine，HA)和炔丙基甘氨酸(propargylglycine， PAG)，對建立大鼠腦缺血再灌注模型后的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷和腦組織炎癥變化的影響，并探討其炎癥反應(yīng)機(jī)制。采用病理切片和HE染色的方法觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)的變化;免疫組化和Westen blot方法檢測大鼠腦缺血再灌注中腦組織H2S生成酶CBS表達(dá)變化;ELISA方法檢測H2S對腦缺血再灌注中炎癥介質(zhì)的影

4、響。為了證明H2S通過抗炎發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在從神經(jīng)元、炎性因子、內(nèi)源性H2S等方面，證明H2S的抗腦缺血再灌注損傷作用，并為其提供理論依據(jù)。
　　方法:選用純系健康雄性Wistar大鼠，體重310g左右，將動(dòng)物隨機(jī)分為9組，正常組(Normal group)，假手術(shù)組(sham)，腦缺血再灌注組(ischemia-reperfusion injury:IR)，硫化氫治療組（IR+NaHS）根據(jù)注射劑量進(jìn)一

5、步分為:2mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg4個(gè)亞組，硫化氫羥氨抑制組（IR+NaHS+HA），硫化氫炔丙基甘氨酸抑制組（IR+NaHS+PAG）。每組5只動(dòng)物，采用四血管阻斷法(4-VO)制作VD大鼠模型，假手術(shù)組麻醉其手術(shù)過程與VD模型組相同，但不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠腦組織，制作大腦切片;HE染色，采用光鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化;采用免疫組化的方法檢測CBS表達(dá)情況

6、;取雙側(cè)海馬組織并勻漿，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-1β，TNF-α;采用Western blot方法檢測各組大鼠海馬組織CBS表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1.形態(tài)學(xué): Normal組和Sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，無明顯的細(xì)胞損傷。IR組大鼠出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞損傷，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稀疏，排列紊亂;核仁消失;硫化氫治療組中，2，5 mg/kg劑量組海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與I

7、R組基本一致;10 mg/kg組與IR組相比，神經(jīng)元數(shù)量有所增加，可見不完整的錐體細(xì)胞層;20 mg/kg組神經(jīng)元存活狀態(tài)明顯改善，組織學(xué)特征與Normal組和Sham組類似，神經(jīng)元排列比較整齊，細(xì)胞形態(tài)也比較完整。IR+NaHS+HA組和IR+NaHS+PAG組與硫化氫治療組20mg/kg相比出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞損傷。2蛋白CBS的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示，Normal組、Sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見到一定量CBS陽性免疫顆粒，呈棕黃色，

8、染色較淺，均勻分布。與Sham組相比，IR組大鼠海馬CA1的CBS陽性免疫顆粒顯著減少，甚至在錐體細(xì)胞層及其周圍出現(xiàn)大片CBS表達(dá)缺失區(qū)域。與IR組相比，低劑量硫化氫(2、5mg/kg)海馬CA1區(qū)CBS的免疫陽性染色強(qiáng)度均無明顯變化，隨著硫化氫的劑量加大免疫染色陽性隨之增強(qiáng)。硫化氫大劑量(20mg/kg)組大鼠可見大量棕褐色CBS陽性免疫顆粒分布于海馬CA1區(qū)，尤其在海馬錐體細(xì)胞層可見大量、深染的CBS陽性顆粒包繞錐體神經(jīng)元細(xì)胞。IR

9、+NaHS+HA組和IR+NaHS+PAG組與硫化氫治療組20mg/kg相比，CBS陽性免疫顆粒明顯減少。3.westen blot結(jié)果:在Normal組和Sham組動(dòng)物海馬CA1區(qū)組織內(nèi)有CBS蛋白的基礎(chǔ)生成。與sham組相比，全腦缺血組的CBS的蛋白表達(dá)全腦缺血后顯著降低。大劑量硫化氫可明顯上調(diào)全腦缺血大鼠CBS蛋白的表達(dá);而低劑量硫化氫對全腦缺血大鼠CBS蛋白表達(dá)下調(diào)無明顯影響。同時(shí)注射HA和PAG后硫化氫誘導(dǎo)的CBS的蛋白表達(dá)上

10、調(diào)作用消失。4.ELISA結(jié)果:在Normal組和Sham組動(dòng)物海馬CA1區(qū)組織內(nèi)有IL-1β和TNF-α蛋白的基礎(chǔ)生成。與Normal組和Sham組相比，腦缺血組動(dòng)物的IL-1β和TNF-α蛋白濃度于腦缺血后顯著上調(diào)。治療性給予硫化氫后，明顯抑制了腦缺血引起的IL-1β和TNF-α蛋白生成的上調(diào)，表現(xiàn)為其上升的高峰顯著降低。并且，大劑量組（20mg/kg）的抑制作用最為明顯。IR+NaHS+HA組和IR+NaHS+PAG組與硫化氫治療