硫化氫保護(hù)腦缺血后的血腦屏障損傷.pdf

1、第一部分硫化氫對小鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的保護(hù)作用
　　目的:觀察硫化氫(H2S)對小鼠腦缺血再灌注損傷是否具有血腦屏障保護(hù)作用。
　　方法:利用兩種結(jié)構(gòu)不具相關(guān)性的H2S供體ADT(5-(4-methoxyphenyl)-3H-1,2-dithiole-3-thione,ADT)及NaHS研究H2S是否在腦缺血后保護(hù)血腦屏障。雄性ICR小鼠接受1小時大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral

2、artery occlusion, tMCAO),再灌注3小時后隨機(jī)分為三組,腹腔注射溶劑(Vehicle,Veh)、ADT(50mg/kg/day)或NaHS(25μmol/kg/day)。用亞甲基藍(lán)方法檢測ADT和NaHS注射后小鼠血液H2S水平;以TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色法測定小鼠腦梗死體積,以Longa法評估神經(jīng)行為學(xué)功能,以伊文思藍(lán)(evans blue)染色法檢測血腦屏障損傷,以免疫印跡法(western

3、blotting)檢測血腦屏障緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:與control組相比,ADT在給藥后45分鐘及3小時升高血液H2S的水平,但是NaHS僅在注射45分鐘后升高血液H2S的水平。ADT在腦缺血再灌注48小時后顯著降低腦梗死體積,其中皮層、紋狀體、半球梗死面積分別減少了35.3％、16.9％、33.8％;并降低神經(jīng)學(xué)評分。ADT和NaHS在腦缺血再灌注后48小時后,明顯降低伊文思藍(lán)滲透率。Wes

4、tern blotting結(jié)果顯示ADT可以抑制腦缺血導(dǎo)致的血腦屏障相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1表達(dá)量的下降。
　　結(jié)論:硫化氫可以保護(hù)腦缺血再灌注后的血腦屏障。
　　第二部分硫化氫供體ADT腦缺血再灌注損傷后保護(hù)血腦屏障的作用機(jī)制
　　目的:研究硫化氫供體ADT在腦缺血再灌注后保護(hù)血腦屏障的機(jī)制:是否抑制腦缺血后NF-κB活化導(dǎo)致的炎癥因子和NADPH氧化酶(NOX)的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　方法:將雄性ICR小

5、鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、溶劑對照組(Vehicle,Veh)組和ADT組;24或48小時取缺血側(cè)和非缺血側(cè)腦組織為標(biāo)本,通過實(shí)時定量PCR(QPCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)試劑盒、NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide2'-phosphate reduc

6、ed tetrasodium salt)氧化酶試劑盒檢測腦組織中的多種炎癥因子和抑炎因子的表達(dá)情況,以及髓過氧化物酶、NADPH氧化酶的活性;利用明膠酶譜(zymography)法,檢測腦組織中金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases,MMP-9)的活性;用免疫印跡法(western bloting)檢測細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果:QPCR結(jié)果顯示,與Sham組相比,Veh組小鼠的缺血

7、皮層組織中促炎因子IL-1β(interleukin-1β)和iNOS(induced nitric oxide synthase)以及NOX2(NADPH oxidase2)和NOX4(NADPH oxidase4)的表達(dá)水平明顯升高,而以Arg-1(Arginase1)和IL-10為代表的抑炎因子的表達(dá)明顯降低;與Veh相比,ADT減少IL-1β、iNOS等促炎因子表達(dá),增加Arg-1和IL-10為代表的抑炎因子的表達(dá),并降低NOX

8、4的表達(dá)。髓過氧化物酶和NADPH氧化酶試劑盒法顯示,與Sham組相比,Veh小鼠的缺血皮層髓過氧化物酶和 NADPH氧化酶的活性明顯上升;而與 Veh相比, ADT減少髓過氧化物酶和NADPH氧化酶的活性。明膠酶譜顯示,與Sham組相比, Veh組小鼠的缺血皮層MMP-9的活性上升;與Veh相比,ADT降低腦缺血后MMP-9活性的升高。腦缺血后NF-κB亞單位p65向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)是NF-κB活化的標(biāo)記。Western blotting

9、結(jié)果顯示:與Sham組相比,Veh組小鼠皮層的細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB亞單位p65的水平明顯增高,而與Veh相比,ADT可明顯減少細(xì)胞核內(nèi)NF-κB亞單位p65的水平;與 Sham組相比,Veh組小鼠皮層細(xì)胞胞漿內(nèi)的NF-κB亞單位 p65水平降低,而與Veh相比,ADT可明顯增加細(xì)胞胞漿內(nèi)的NF-κB亞單位p65的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明ADT抑制腦缺血導(dǎo)致的NF-κB活化。
　　結(jié)論: ADT在小鼠腦缺血再灌注損傷后保護(hù)血腦屏障的作