硫化氫緩解缺血再灌注腎損傷機(jī)制研究.pdf

1、急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)是由各種病因引起，腎功能在短期內(nèi)(數(shù)小時(shí)至數(shù)天)迅速減退，腎小球?yàn)V過功能顯著下降，血尿素氮及肌酐迅速升高，并引起機(jī)體水、電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)，以及急性尿毒癥等的臨床綜合癥狀。腎缺血再灌注導(dǎo)致的腎臟損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是導(dǎo)致缺血性ARF的主要原因，在器官移植中更是難以避免。RIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及自由基的作用、細(xì)胞

2、鈣超載、能量代謝障礙等，有資料顯示炎性介質(zhì)、粘附分子、多種細(xì)胞因子參與RIRI，但至今其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。
　　急性腎衰竭中腎臟損傷若不能及時(shí)修復(fù)，可導(dǎo)致病變持續(xù)數(shù)周甚至多年，轉(zhuǎn)變成不可逆的慢性進(jìn)行性腎功能不全。2010年12月，Kidney International雜志連續(xù)刊登5篇review，均把腎移植后腎功能變化的關(guān)注焦點(diǎn)集中在遠(yuǎn)期效應(yīng)上，從對腎移植后的遠(yuǎn)期保護(hù)性干預(yù)、感染與慢性移植腎損傷、病理學(xué)改變等方面探討了慢性移

3、植損傷。關(guān)于腎缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)的研究，局限于24 hr以內(nèi)的急性期和單一的觀察時(shí)間點(diǎn)明顯不夠，因此，在本課題中選擇了缺血再灌注6 hr、24 hr、3d、7d和21d作為觀察時(shí)間點(diǎn)，以充分反應(yīng)急性期和亞急性期的腎損傷情況。
　　硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化碳和一氧化氮之后的又一內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，近年來H2S在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)受到廣泛關(guān)注。最新研究表明其

4、在機(jī)體內(nèi)參與多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，內(nèi)源性H2S代謝異常與多種系統(tǒng)疾病，包括循環(huán)、消化、神經(jīng)、呼吸等系統(tǒng)疾病發(fā)生關(guān)系密切。
　　內(nèi)源性H2S主要有兩大來源：酶合成途徑和非酶途徑。酶合成途徑是體內(nèi)H2S的主要來源，通過體內(nèi)的半胱氨酸5-磷酸毗哆醛依賴性的酶-胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-cynthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化產(chǎn)生H2S。CBS和CSE

5、的表達(dá)具有組織特異性，腎臟中同時(shí)存在CBS和CSE表達(dá)，且H2S合成水平較高。然而關(guān)于內(nèi)源性H2S在腎臟生理與病理生理過程中的作用至今報(bào)道很少，且主要圍繞高血壓腎病和糖尿病腎病。
　　本課題組前期報(bào)道了H2S對糖尿病腎病具有保護(hù)作用，明確糖尿病早期CSE表達(dá)減少，與高糖引起的腎臟組織氧化應(yīng)激發(fā)生有關(guān)。在離體培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中，外源性給予NaHS(H2S供體)可抑制高糖引起的活性氧增多?；钚匝跎稍黾邮侨毖俟嘧⒅缕鞴贀p傷的共同

6、特征和重要機(jī)制。關(guān)于H2S在I/R中的作用，已有的文獻(xiàn)報(bào)道，在心血管系統(tǒng)中，特別是心肌缺血再灌注中，H2S能緩解心肌損害，然而，在腎臟缺血再灌注過程中，內(nèi)源性H2S生成有何變化，H2S能否通過緩解腎臟I/R氧化應(yīng)激的發(fā)生而發(fā)揮保護(hù)作用，如果H2S能有保護(hù)作用，其在體內(nèi)的作用途徑和具體機(jī)制是什么等都是我們在本課題中關(guān)心的問題。
　　腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)是腎小球內(nèi)一種固有的血管外周細(xì)胞，具有舒縮功能

7、，參與腎小球血流量的調(diào)節(jié)。目前已有大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，MCs的異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和分泌異常升高是腎小球硬化最重要的原因。以往對I/R的損傷研究集中于腎小管細(xì)胞，但在我們的實(shí)驗(yàn)中明確觀察到，I/R可引起腎臟炎癥因子和纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)成倍上調(diào)，且腎皮質(zhì)的變化早于髓質(zhì)，提示腎小球固有細(xì)胞可能在其中發(fā)揮作用。2010年Kim的報(bào)道也提示，在RIRI的發(fā)生機(jī)制中，腎臟的不同細(xì)胞可以

8、表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。然而，關(guān)于MCs是否參與RIRI，特別是急性期過后的腎損傷則沒有明確答案。因此，本課題中，我們結(jié)合整體動(dòng)物模型的觀察結(jié)果，選擇腎小球系膜細(xì)胞作為離體研究的對象，采用缺氧-復(fù)氧模型開展研究。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到諸如缺血、缺氧、鈣超載、ATP耗竭等應(yīng)激刺激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白堆積等引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)乃至細(xì)胞功能紊亂的狀態(tài)。ER

9、S是細(xì)胞的一種自我保護(hù)性機(jī)制，適度的ERS可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)來保護(hù)由ERS所引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能。但過強(qiáng)或時(shí)間過長的ERS則將誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的大量釋放，甚至啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　腎缺血和再灌注可引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，后者又與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。一方面有研究表明，缺血再灌注可啟動(dòng)強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并激活細(xì)胞

10、凋亡途徑；但同時(shí)，翼志勇等報(bào)道，通過預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生可有效減少I/R引起的腎損傷。ERS作為一把雙刃劍，是參與I/R的損傷機(jī)制還是在其中發(fā)揮保護(hù)作用，硫化氫對ERS又有何作用等也是本課題所關(guān)心的問題。
　　由此，本論文由三部分組成：
　　一、缺血再灌注損傷過程中內(nèi)源性H2S生成改變及給予外源性H2S對缺血再灌注腎損傷的緩解作用
　　1.本課題研究采用夾閉大鼠腎動(dòng)脈造成腎雙側(cè)缺血，60 min后恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注

11、的腎臟缺血再灌注動(dòng)物模型。首先于缺血再灌注后6 hr觀察到腎皮質(zhì)H2S濃度低于假手術(shù)組，但腎髓質(zhì)尚無變化。外源性給予NaHS(100μg/kg)對假手術(shù)大鼠血肌酐、尿素氮無影響，也不引起正常大鼠腎臟的形態(tài)學(xué)改變。
　　2.實(shí)驗(yàn)共收集5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物樣本，分別為再灌注后6 hr、24 hr、3d、7d和21d，收集樣本包括24小時(shí)尿液、血清和腎臟組織。腎功能和尿蛋白結(jié)果顯示，腎缺血再灌注后6 hr，I/R組血肌酐、尿素氮已顯著升高，

12、隨時(shí)程延長，雖有緩解，但血肌酐、尿素氮數(shù)值始終高于假手術(shù)組。HE染色同樣提示腎臟存在病理改變。
　　3.腎組織缺血后50 min，即再灌注前10 min，腹腔注射NaHS，作為I/R+NaHS組。對該組大鼠腎功能、尿蛋白和病理形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果顯示，腎缺血再灌注后的急性期內(nèi)，即6 hr和24 hr的腎臟功能和形態(tài)學(xué)改變與I/R組一致，但7d和21 d時(shí)都顯著優(yōu)于I/R組，提示再灌注前外源性給予H2S可以改善缺血再灌注腎臟亞急性期的損

13、傷效應(yīng)。
　　4.炎癥因子的異常啟動(dòng)，腎臟組織出現(xiàn)非特異性炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的重要因素，其中白介素6(interleukin6，IL-6)是參與腎臟非特異性炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子之一。本實(shí)驗(yàn)中檢測了大鼠血清IL-6水平，觀察到缺血再灌注6 hr后，I/R與I/R+NaHS組血清IL-6水平均有顯著上升，較假手術(shù)組高出近3倍，此后，IL-6水平下降，但I(xiàn)/R組仍持續(xù)高于假手術(shù)組，而I/R+NaHS組則從24 hr起即與假手術(shù)組

14、無差別。腎臟皮質(zhì)IL-6 mRNA水平I/R組在5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)都顯著升高，峰值出現(xiàn)在24 hr，約為假手術(shù)組的8倍。I/R+NaHS組腎皮質(zhì)IL-6表達(dá)水平也顯著升高，但低于I/R組。腎臟髓質(zhì)IL-6表達(dá)水平I/R組與I/R+NaHS組在缺血再灌注后6 hr都無明顯變化。I/R組從24 hr點(diǎn)起，表達(dá)水平顯著升高，3d時(shí)達(dá)高峰，可達(dá)假手術(shù)組的6倍。I/R+NaHS組自3d起，也觀察到IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)，但低于I/R組。上述結(jié)果提

15、示，腎組織IL-6水平在腎缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的升高，且主要來源并非血液循環(huán)。腎皮質(zhì)的表達(dá)水平升高早于髓質(zhì)。給予外源性H2S能部分抑制IL-6生成的增多，減輕非特異性炎癥反應(yīng)。
　　單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子家族的重要成員，在腎損害中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)中也觀察了腎皮質(zhì)MCP-1的表達(dá)水平，其在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出了與IL-6同樣的變

16、化趨勢，進(jìn)一步確認(rèn)了I/R可引起組織局部非特異性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，及H2S能抑制該反應(yīng)的效應(yīng)。
　　5.腎臟纖維化是導(dǎo)致腎功能減退的重要病理改變之一。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)是促進(jìn)纖維化的重要細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)中檢測了腎皮質(zhì)TGF-β的mRNA水平，觀察到24 hr I/R與I/R+NaHS組TGF-β表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯變化。但3d起，表達(dá)水平顯著升高，I/R組TGF-β

17、mRNA水平約為假手術(shù)組的8倍，I/R+NaHS組則顯著低于I/R組。纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是TGF-β重要的下游效應(yīng)分子，也是腎組織重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，與TGF-β共同參與了腎纖維化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中觀察到腎皮質(zhì)FN mRNA水平在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出與TGF-β相一致的變化趨勢，提示腎臟在缺血再灌注急性期過去后，可出現(xiàn)纖維化相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，這可能是遠(yuǎn)期腎臟發(fā)生纖維化并引起腎功能減退的重要原因。

18、而外源性給予H2S能顯著抑制上述基因的表達(dá)上調(diào)，提示H2S將可能有助于緩解腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展以及繼發(fā)的慢性腎功能損傷。
　　二、H2S抑制I/R引起的組織活性氧生成及缺氧-復(fù)氧引起的系膜細(xì)胞功能變化
　　1.腎缺血再灌注后6 hr、24 hr、3d、7d和21d分別收集腎臟組織，勻漿后以lucigenin為探針，用化學(xué)發(fā)光技術(shù)定量測定組織活性氧水平。結(jié)果顯示，腎缺血再灌注引起腎組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen

19、species，ROS)水平升高，外源性給予硫化氫可抑制ROS生成的增多。
　　2.課題研究選擇離體培養(yǎng)腎臟系膜細(xì)胞作為細(xì)胞水平研究的對象，將細(xì)胞置于缺氧試劑盒中培養(yǎng)2h，然后恢復(fù)常氧繼續(xù)培養(yǎng)，建立缺氧-復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)細(xì)胞模型，模擬機(jī)體缺氧/再灌注損傷模型。利用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行細(xì)胞水平活性氧檢測，觀察到缺氧2h后復(fù)氧時(shí)，細(xì)胞ROS水平顯著升高，隨后下降，在復(fù)氧2h恢復(fù)至對照水平

20、，繼而再次升高，在6h達(dá)峰值，并于12 h再次恢復(fù)至對照水平。采用缺氧前和復(fù)氧初兩次給予NaHS(30μM)，可抑制H/R引起的ROS生成增多。僅缺氧前給予NaHS預(yù)處理，雖然對復(fù)氧初的ROS增多有一定抑制作用，但對后繼出現(xiàn)的第二次ROS水平升高無顯著影響。若僅在復(fù)氧后給予NaHS，則可明顯抑制第二次ROS生成高峰，提示H/R引起的ROS增多可出現(xiàn)兩次高峰，其中缺氧可能與第一次高峰的出現(xiàn)有關(guān)，而復(fù)氧引起ROS第二次高峰。因此，復(fù)氧后給予

21、NaHS處理可抑制ROS生成的第二個(gè)高峰。
　　3.H/R引起系膜細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)增加，培液IL-6水平升高，在復(fù)氧初給予NaHS，可顯著抑制上述效應(yīng)，提示在細(xì)胞水平，H2S也抑制了非特異性炎癥反應(yīng)。另外，NaHS還可抑制H/R引起的系膜細(xì)胞增殖效應(yīng)。由于腎小球硬化，腎臟纖維化等病理變化中，系膜細(xì)胞過度增殖及分泌的細(xì)胞因子都起了重要作用，因此，NaHS抑制H/R引起的IL-6水平升高和系膜細(xì)胞的增殖作用，在整體上可能是其

22、改善腎缺血再灌注后腎損傷的細(xì)胞機(jī)制之一。
　　4.實(shí)驗(yàn)中給予NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘(diphenylenechloride iodonium，DPI)后，可完全抑制H/R引起的ROS增多，提示H/R引起的ROS生成增加主要來自NADPH氧化酶代謝途徑。給予DPI處理也抑制了H/R引起的IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)和系膜細(xì)胞增殖效應(yīng)，提示IL-6的生成和細(xì)胞的增殖是由ROS生成增加所致。
　　三、腎缺血再灌注激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

23、應(yīng)激
　　1.腎缺血再灌注后，腎組織可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulating protein78，GRP78)水平顯著升高。在細(xì)胞水平，缺氧-復(fù)氧引起系膜細(xì)胞GRP78蛋白水平和真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α，eIF2α)磷酸化水平升高，提示腎臟缺血再灌注或細(xì)胞缺氧，復(fù)氧可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。
　　2.給予外源性H2S抑制了24

24、 hr時(shí)間點(diǎn)觀察到的缺血再灌注引起的組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及缺氧-復(fù)氧后12 hr時(shí)間點(diǎn)時(shí)所觀察到的系膜細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在離體培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中，單純給予NaHS不影響正常細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。
　　3.在系膜細(xì)胞上給予ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)或衣霉素(tunicamycin，TM)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，用NaHS預(yù)處理對TG或TM引起的GRP78蛋白水平和eIF2α磷酸化水平無影響，提示硫化氫本身對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可

25、能無明顯直接抑制效應(yīng)，其抑制腎缺血再灌注或缺氧.復(fù)氧引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上游刺激因子，如ROS、炎癥因子等的生成有關(guān)。
　　綜上所述，本研究詳細(xì)觀察了腎缺血再灌注后早期腎臟功能、形態(tài)學(xué)、組織局部ROS、炎癥因子和纖維化相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化過程，為尋找和闡明腎功能障礙的早期發(fā)生機(jī)制提供了有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。課題中觀察到硫化氫可抑制缺血再灌注腎組織的活性氧升高，減少組織局部的炎癥因子和纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，這對于