不同藥物干預(yù)心、腎缺血再灌注損傷的作用與機(jī)制研究.pdf

1、缺血所引起的重要功能器官損傷是致死性疾病的主要原因，諸如心肌梗死、腦卒中、肝腎衰竭等。通過治療手段使血液灌注恢復(fù)后，缺血器官功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury，I/R）。長期以來，缺血再灌注損傷一直是臨床治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，但近年來臨床治療方法一直沒有明顯進(jìn)步。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，建立了心、腎缺血再灌注損傷動(dòng)物和細(xì)胞模型，觀察了骨骼肌分泌的小分

2、子代謝調(diào)節(jié)功能蛋白——鳶尾素(Irisin)、直接腎素抑制劑——阿利吉侖(Aliskiren)、D2類多巴胺受體D3亞型激動(dòng)劑——PD128907對(duì)于缺血再灌注損傷的治療作用，從不同的切入點(diǎn)探討了氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)與I/R損傷治療的關(guān)系，研究結(jié)果可能促進(jìn)缺血再灌注損傷治療的相關(guān)理論研究。具體分三部分闡述。
　　第一部分 鳶尾素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用和機(jī)制研究
　　目的:
　　揭示肌源性因子——鳶尾素對(duì)急性心肌缺血/再灌

3、注損傷保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.在體研究，采用缺血45min再灌注24h誘導(dǎo)大鼠心肌急性缺血/再灌注損傷模型。鳶尾素在再灌注前即刻給予，以評(píng)估心肌保護(hù)作用。大鼠處死前，超聲測(cè)定觀察心臟的結(jié)構(gòu)和功能;處死后留取血液樣本檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物，以迸一步確定心肌保護(hù)作用。TTC染色觀察心肌梗死面積;TUNEL法評(píng)價(jià)組織的細(xì)胞凋亡率;心臟標(biāo)本留取用于檢查細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平，以觀察鳶尾素預(yù)處理對(duì)心肌壞死、凋亡、氧化應(yīng)激的影

4、響，以探索其可能機(jī)制。
　　2.體外研究，以H9c2細(xì)胞為觀察對(duì)象。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放水平和細(xì)胞存活率被用來評(píng)估鳶尾素預(yù)處理對(duì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的保護(hù)作用。免疫熒光染色觀察亞細(xì)胞細(xì)胞器中鳶尾素的定位;DCFH-DA熒光探針用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成水平;測(cè)量線粒體膜電位以評(píng)估線粒體功能;應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)超氧化物歧化酶家族和鳶尾素的共定位及表達(dá);用透射電子顯微鏡觀察亞細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的變化，以探討鳶尾素保護(hù)作用的可能機(jī)制

5、。
　　3.采用大鼠左股動(dòng)脈無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉5min，開放5min，5個(gè)循環(huán)的方法進(jìn)行遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)處理。免疫印跡法和ELISA方法檢測(cè)遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)刺激后血清鳶尾素濃度。通過免疫組化染色確定心肌組織中鳶尾素的分布。
　　結(jié)果:
　　1.RIPC恢復(fù)了I/R損傷后血清鳶尾素的濃度并增高了鳶尾素在心肌組織損傷區(qū)的表達(dá)。
　　2.動(dòng)物模型研究顯示，靜脈注射外源性鳶尾素可以劑量依賴性的減少心肌缺血再灌注損傷模型的心肌梗死

6、面積，下調(diào)心肌損傷標(biāo)志物肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和肌酸激酶(CK)的血清水平，降低乳酸脫氫酶(LDH)活性，與溶劑對(duì)照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。鳶尾素也改善了心功能，恢復(fù)了I/R組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，與溶劑對(duì)照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。給藥前對(duì)鳶尾素進(jìn)行高溫處理或者用抗體(抗體∶鳶尾素=5∶1)中和可以消除鳶尾素的心肌保護(hù)作用。鳶尾素治療I/R組，心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白（casepase3和Ba

7、x）的表達(dá)和活性，以及氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA，MPO)都顯著降低，而抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達(dá)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性都明顯恢復(fù)，與溶劑對(duì)照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。
　　3.鳶尾素預(yù)處理呈劑量依賴性預(yù)防無氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，保護(hù)細(xì)胞的完整性，并抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。鳶尾素處理促進(jìn)了和線粒體SOD2的共定位，升高線粒體膜電位，改善線粒體功能。電子顯微鏡觀察表明，鳶尾素可以增加細(xì)胞中的線粒體數(shù)量，減輕

8、無氧/復(fù)氧損傷引起的線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞。
　　結(jié)論:
　　1.骨骼肌分泌的功能小分子蛋白——鳶尾素具有心肌保護(hù)作用。
　　2.其主要保護(hù)機(jī)制可能與鳶尾素通過向線粒體轉(zhuǎn)位，抑制線粒體SOD2降解，減少氧化應(yīng)激，抑制Bax凋亡蛋白表達(dá)，抑制凋亡通路關(guān)鍵激酶Caspase3的活性，減少心肌細(xì)胞凋亡，可能是鳶尾素心肌保護(hù)的主要機(jī)制。
　　3.肢體遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(RIPC)可以誘導(dǎo)循環(huán)中鳶尾素含量增加，血漿鳶尾素可向受損心

9、肌轉(zhuǎn)移，鳶尾素可能是介導(dǎo)骨骼肌遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)的重要內(nèi)源性媒介之一。提示鳶尾素可能是應(yīng)激條件下參與病理性氧化應(yīng)激再平衡的重要內(nèi)源性因素。
　　第二部分 阿利吉侖對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:
　　評(píng)估直接腎素抑制劑——阿利吉侖在急性腎缺血/再灌注損傷模型中的作用和探討可能的機(jī)制。
　　方法:
　　通過構(gòu)建單一左腎缺血45min/再灌注24h的大鼠腎缺血再灌注損傷模型，觀察阿利吉侖預(yù)處理（缺血

10、前15min）對(duì)腎功能、病理變化、血漿血管緊張素Ⅱ水平、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激水平和炎癥的影響，以評(píng)估其腎I/R損傷保護(hù)作用及與凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　與假手術(shù)組相比，血清肌酐(Scr)、血尿素氮（BUN）在I/R大鼠顯著增加，伴有腎組織病理學(xué)損傷，包括腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落和栓塞的形成，證明單腎缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功。與假手術(shù)組大鼠相比，I/R組有更多的凋亡細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤。阿利吉侖預(yù)處理減輕了I/

11、R損傷誘導(dǎo)的腎損傷，降低血清肌酐和尿素氮水平，改善腎組織學(xué)病理變化，降低腎小管細(xì)胞凋亡和白細(xì)胞浸潤，降低了血漿血管緊張素Ⅱ水平。I/R損傷也減少了超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽（還原型GSH）的水平，可被阿利吉侖預(yù)處理逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　1.直接腎素轉(zhuǎn)化酶抑制劑——阿利吉侖(Aliskiren)的預(yù)防性應(yīng)用可以有效拮抗大鼠腎缺血再灌注損傷，并減少腎臟上皮細(xì)胞的壞死和凋亡，保護(hù)了靶器官功能，減輕了繼發(fā)炎癥反應(yīng)。其機(jī)制可

12、能與抑制局部和全身RAS系統(tǒng)激活，降低AngⅡ合成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。
　　第三部分 多巴胺D3受體激活促進(jìn)與Gα12連接上調(diào)減輕腎缺血/再灌注損傷
　　目的:
　　研究多巴胺受體D3R激動(dòng)劑PD128907誘導(dǎo)的多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的交互作用對(duì)急性腎缺血/再灌注損傷和NRK-52E細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用和機(jī)制。
　　方法:
　　1.在體研究，動(dòng)物模型構(gòu)建方法同第二部分。多巴胺受體D3

13、R激動(dòng)劑PD128907（0.2 mg/kg，iv），或溶劑對(duì)照，在誘導(dǎo)缺血（或缺氧）前15分鐘給藥。收集血液和腎臟標(biāo)本檢查腎功能，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的共連接水平。
　　2.體外研究，通過檢測(cè)G蛋白α12亞基過表達(dá)的NRK52E細(xì)胞的細(xì)胞生存率和培養(yǎng)上清液中LDH釋放水平來評(píng)價(jià)PD128907預(yù)處理對(duì)H/R損傷的影響。
　　結(jié)果:
　　1.多巴胺受體D3R激動(dòng)劑PD128

14、907預(yù)處理可減輕大鼠單腎缺血再灌注損傷。PD128907預(yù)處理能增加腎谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平;降低MDA水平;使促炎因子TNF-α和IL-1β下調(diào)，抗炎因子IL-10β上調(diào)，髓質(zhì)過氧化物酶活性降低;與此結(jié)果平行，腎小管上皮細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物的表達(dá)和活性都下調(diào)。
　　2.PD128907預(yù)處理還促進(jìn)了I/R損傷后多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的共連接水平增加。
　　3.細(xì)胞模型的研究表明，NRK-52E細(xì)胞

15、過表達(dá)G蛋白α12亞基減弱了PD128907對(duì)H/R損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.多巴胺受體D3亞型激動(dòng)劑PD128907的預(yù)防性應(yīng)用同樣可以降低大鼠腎缺血再灌注損傷模型，相應(yīng)減少腎臟上皮細(xì)胞的壞死和凋亡，減輕了繼發(fā)炎癥反應(yīng)，改善遠(yuǎn)期生存率。該結(jié)果在NRK-52E細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型中也得到驗(yàn)證。
　　2.其機(jī)制可能與錨定傳遞胞外氧化應(yīng)激損傷信號(hào)的重要G蛋白亞基Gα12，阻斷損傷性氧化應(yīng)激信號(hào)傳遞，減輕局部和細(xì)