兔肺缺血再灌注損傷致ALI免疫發(fā)病機制及藥物干預的實驗研究.pdf

1、研究表明，再灌注可以觸發(fā)一系列損傷反應，引起相應臟器致命性損傷。人們發(fā)現(xiàn)肺移植、體外循環(huán)手術(shù)、肺動脈血栓內(nèi)膜剝除術(shù)、肺栓塞溶栓治療等多種臨床情況下發(fā)生肺缺血后再灌注，肺損傷不但沒有減輕反而加重，臨床上將這種現(xiàn)象稱為肺缺血再灌注損傷(LungIschemia-Reperfusionlung Injury，LIRI)。再灌注肺損傷的確切發(fā)生機制尚不十分清楚，可能與炎性介質(zhì)、氧自由基、肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮損傷等多種因素有關。由于大量炎性介質(zhì)和

2、細胞因子的釋放在再灌注早期可能導致肺微血管通透性增加。目前尚存在一些有待進一步研究和解決的問題，如能更深入地探討其發(fā)生機制、尋找更加有效的防治方法，對降低病死率，提高治愈率具有十分積極的意義。近年來，不斷探索尋找干預措施和藥物以減輕再灌注損傷，研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理(ischemic postconditioning)是其中最有力的保護機制，已成為新的研究熱點。再灌注在臨床上是個可以預見并且可以控制的過程，有學者研究發(fā)現(xiàn)通過“溫和再灌注”可

3、以減少梗塞面積、減輕水腫、避免無復流反應，提出了缺血后適應的概念。為此，我們以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法，通過夾閉阻斷一側(cè)肺門(肺動脈、肺靜脈、支氣管動脈和支氣管)，造成一側(cè)肺組織完全缺血和停止通氣，而后冉殲放肺門以形成肺組織的再灌注來建立在體兔肺缺血再灌注損傷模型，從肺實質(zhì)損傷、肺血管通透性、肺間質(zhì)改變、闡明肺缺血/再灌注肺損傷的發(fā)生機制，為尋找更加有效的防治方法，進一步降低病死率，提高治愈率提供理論依據(jù)。同時藥物的應

4、用是圍手術(shù)期的重要環(huán)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)某些藥物如利多卡因，地塞米松，山茛菪堿預處理對肺缺血再灌注損傷致急性肺損傷(ALI)具有保護作用，但仍有爭議，有關其后處理作用的研究較少，所以深入研究常用藥物對肺缺血再灌注損傷致ALI的影響具有重要的臨床意義。本研究采用兔肺缺血再灌注損傷模型，探討利多卡因，地寒米松，山莨菪堿預處理及后處理的肺保護作用，以期為臨床合理選擇藥物提供理論依據(jù)，為藥物臟器保護作用的深入研究開辟思路。
　　 實驗內(nèi)容主

5、要包括以下二部分：
　　 第一章：兔肺缺血再灌注損傷致ALI模型的建立及免疫發(fā)病機制研究
　　 目的：探討肺缺血/再灌注肺損傷致ALI的發(fā)生機制。
　　 方法：本實驗以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法，通過夾閉阻斷一側(cè)肺門(肺動脈、肺靜脈、支氣管動脈和支氣管)，造成一側(cè)肺組織完全缺血和停止通氣，而后再開放肺門以形成肺組織的再灌注來建立在體兔肺缺血冉灌注損傷模型。觀察肺組織形態(tài)學變化、干/濕重比、肺組織和

6、BALF中TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8的動態(tài)變化；采用免疫組織化學和原位雜交方法研究了肺缺血再灌注過程中TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8肺組織中的分布。
　　 結(jié)果：①BALF中白細胞計數(shù)：與對照組相比，肺缺血60min、BALF中白細胞數(shù)量明顯增多；再灌注60min后進一步增高，并于再灌注120min達到高峰(22.36±1.65，24.17±1.28，54.93±3.65，P<0.01)。再灌注60min

7、、冉灌注120min明顯高于缺血60min、120min水平，再灌注120min明顯高于再灌注60min水平(P均<0.01)。②肺缺血60min、120min BALF中PMN比例明顯增多，再灌注60min、再灌注120min持續(xù)增高，并于再灌注120min達到峰值(0.88±0.24，1.26±0.84，8.42±0.68，P<0.01)。③肺組織W/D：肺缺血60min、120min組明顯高于對照組和假手術(shù)組；再灌注60min組和

8、再灌注120min組(3.90±0.10，4.19±0.12，5.42±0.66，P<0.01)的W/D比前兩組增高更明顯。④TNF-a的變化：與對照組相比，肺組織勻漿中TNF-a在肺缺血60min時無明顯變化(7.90±1.89，P>0.05)，缺血120min時增高，再灌注60min后繼續(xù)增高，并于再灌注120min達到高峰(6.03±1.24，7.20±1.48，11.56±2.55，P<0.05)。再灌注120min組TNF-a

9、高于再灌注60min組(P<0.05)，并且明顯高于肺缺血60min組和120min組(P<0.05)。BALF中TNF-a的變化趨勢與肺組織勻漿中TNF-a的動態(tài)改變相同。⑤IL-1，IL-6，IL-8的變化：與對照組相比，肺組織勻漿中IL-1，IL-6，IL-8在肺缺血60min時明顯升高(0.38±0.09，P<0.05)，缺血120min時升高，再灌注60min后繼續(xù)升高，并于再灌注120min最為明顯(0.29±0.09，0.

10、39±0.12，1.45±0.33，P<0.05)；并且再灌注120min時明顯高于缺血120min(P<0.05)。BALF中IL-1，IL-6，IL-8的變化趨勢亦與肺組織勻漿中IL-1，IL-6，IL-8的動態(tài)改變相同。⑥免疫組織化學染色顯示：兔肺組織中TNF-a陽性細胞主要在肺泡上皮細胞、部分支氣管上皮及炎細胞(單核細胞、粒細胞)內(nèi)大量表達。與對照組相比，肺缺血60min、120min、再灌注60min、120min時，兔肺組織

11、TNF-a的表達均顯著增高(P<0.01)。并且再灌注60min、120min組明顯高于肺缺血60min、120min組，再灌注120min組高于再灌注60min組(P<0.01)。(7)相關性分析表明，TNF-a表達水平分別與W/D、肺組織中TNF-a的含量、BALF中的PMN比例及BALF中TNF-a，含量呈顯著負相關，r值分別為-0.95，-0.93，-0.97，-0.91，P均<0.01；TNF-a表達水平與肺組織及BALF中I

12、L-1，IL-6，IL-8的含量呈顯著正相關，r值分別為0.91和0.94，P均<0.05。(TNF-a陽性表達越高而灰度值越低)(8)透射電鏡顯示超微結(jié)構(gòu)毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、空泡化、部分胞漿溶解，核染色質(zhì)濃縮；Ⅱ型上皮細胞膜表面微絨毛數(shù)量顯著減少，嗜鋨性板層小體幾乎全部空化，線粒體部分或大部分嵴和膜融合消失。
　　 結(jié)論：①本試驗以新西蘭大耳白兔，參考Eppinger的方法成功地建立肺缺血/再灌注的動物模型，動態(tài)觀察了肺缺血

13、、再灌注過程中動脈氧分壓的變化特點。②從肺濕/干重比、組織形態(tài)學變化說明肺缺血/再灌注兩個過程中均存在肺損傷，并且再灌注后損傷更為明顯。③PMN、氧自由基均參與了肺缺血/再灌注肺損傷的過程。④TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8異常表達在肺缺血/冉灌注損傷中起一定作用，推測肺缺血/再灌注肺損傷的可能機制之一 PMN肺內(nèi)聚積、氧自由基爆發(fā)性呼吸介導TNF-a活化而調(diào)控 TNF-a，IL-1，IL-6，IL-8異常表達，導致肺損傷發(fā)生。

14、
　　 第二章：藥物干預兔肺缺血再灌注損傷致ALI的實驗研究
　　 目的：目前肺缺血再灌注損傷致ALI仍然是困擾心胸外科手術(shù)的難題，有關其防治措施的研究尚未獲得理想進展。藥物的應用是圍手術(shù)期的重要環(huán)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)某些藥物如利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預處理對肺缺血再灌注損傷致ALI具有保護作用，但仍有爭議，有關其后處理作用的研究較少，所以深入研究常用藥物對肺缺血再灌注損傷致ALI的影響具有重要的臨床意義。本研究采用兔肺

15、缺血再灌注損傷模型，探討利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預處理及后處理的肺保護作用，以期為臨床合理選擇藥物提供理論依據(jù)，為藥物臟器保護作用的深入研究開辟思路。
　　 方法：成年新西蘭大白兔32只，隨機分為4組(n=32)。(1)缺血再灌注組(1/R組)：開胸游離左肺門后，阻斷左肺門60min，而后松開血管夾形成再灌注；(2)利多卡因預處理組(lido-Pre組)：前10min分別注射利多卡因1.2mg/kg，并分別以1.0mg/(k

16、g.h)維持30min后，阻斷左肺門60min，然后松開血管夾形成再灌注；(3)山莨菪堿后處理組(ansi-PoS組)：開胸游離左肺門后，阻斷左肺門60min，而后松開血管夾形成再灌注；在恢復灌注同時，立即以山蓑若堿2mg/kg隨后以1mg/kg/h靜脈維持30min；(4)地塞米松預處理和后處理組(dex-Pre-PoS組)耳緣靜脈注入地塞米松o.o75mg/kg，30min后，阻斷左肺門60min，然后松開血管央形成再灌注；在恢復灌

17、注同時，地塞米松o.o75mg/kg h靜脈維持30min。各組均于再灌注0min、30min、60min、120min、240min共5個時點分別處死動物，留取動脈血、肺組織和肺泡灌洗液標本，測定動脈血氧分壓，肺泡灌洗液中炎性細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比和蛋白含量，肺組織細胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的濃度和肺泡灌洗液中細胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6.IL-8的表達變化；并行光鏡、電鏡觀察肺組織病理形態(tài)學改

18、變，免疫組化和原位雜交。
　　 結(jié)果：I/R組、lido-Pre組、ani-PoS組、dex-Pre-Pos組均隨著再灌注時間的延長表現(xiàn)出明顯的肺損傷變化，動脈血氧分壓下降，TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8，以及肺泡灌洗液中炎性細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比和蛋白含量均明顯增高，TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的表達增加。與I/R組相比，利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組各項觀察指標在不同時間點均存在統(tǒng)計學差異。利多卡因

19、，地塞米松，山莨菪堿組相比無顯著差異。病理切片顯示，1/R組肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)白細胞聚集成團，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，肺泡腔嚴重出血水腫，肺損傷較利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組更加嚴重。透射電鏡也顯示1/R組Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體窄泡化，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，其改變與利多卡因，地塞米松，山莨菪堿組存在差異。
　　 結(jié)論：利多卡因，地塞米松，山莨菪堿預處理和后處理均能減輕兔肺缺血再灌注損傷，具有明確的肺保護作用。其對再灌注后肺組織損傷的保

20、護作用可能是通過抑制炎癥反應，減少中性粒細胞的浸潤、粘附與遷移，降低肺組織細胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6，IL-8的表達與釋放，下調(diào)肺缺血再灌注損傷所致的表達，進而減少多形核白細胞(PMN)在肺內(nèi)炎癥部位的聚集，降低肺組織的通透性，減少肺組織細胞一特別是肺泡11型上皮細胞的凋亡而實現(xiàn)的。利多卡因，地寒米松，山莨菪堿不同的處理時機一即預處理與后處理，其所產(chǎn)生的對肺缺血再灌注損傷的保護作用大致相似，推測可能是通過相似甚或相同的作用