硫化氫治療肥胖性腎損傷的分子機制.pdf

1、背景：代謝綜合征已成為人類所面臨的主要亞健康問題之一，主要表現(xiàn)為肥胖、血壓升高、甘油三酯升高、心血管疾病、空腹血糖升高、慢性炎癥等多種代謝紊亂。近年來的研究表明代謝綜合癥對腎臟的功能有一定的損害作用，而腎臟在受損之后又反過來加重了代謝綜合癥的發(fā)展。研究表明：肥胖是代謝綜合征的主要誘因，肥胖不僅能誘發(fā)糖尿病、高血壓及胰島素抵抗（IR），肥胖能夠導致腎臟損傷。由肥胖引起的腎損傷在醫(yī)學上統(tǒng)稱為肥胖相關性腎?。∣RG）,有報道稱ORG的臨床表現(xiàn)

2、為血壓升高、血脂升高和微量白蛋白尿出現(xiàn)，病理改變主要為腎小球的體積增大或者腎小球局部出現(xiàn)結節(jié)性硬化，是腎臟病的早期發(fā)展特征。慢性腎臟?。–hronic kidney diesease，CKD）的防治已成為全球所面臨的重大公共健康問題。2012年，Luxia Zhang等人的調查報告指出：在中國，CKD病人的人數(shù)在逐年增加，CKD也已經(jīng)成為了危害公眾健康的重大問題，特別在一些人口密集的農(nóng)村地區(qū)，人數(shù)還在逐年遞增。CKD病人的不斷增加，給全

3、球經(jīng)濟帶來了巨大負擔，因此，尋求可靠的治療方法來改變它的一些危險因素，如血脂異常，已成為研究CKD的一個主要方面。硫化氫一直被認為是一種有惡臭的毒性氣體，直到1990年，有人證明硫化氫（H2S）可以作為調節(jié)神經(jīng)功能的一種神經(jīng)遞質，能夠由細胞中的硫化氫合成酶，利用半胱氨酸為原料進行合成，硫化氫作為內源性的氣體信號分子才廣泛被人們接受（或認知）。隨著對硫化氫生理功能研究不斷深入，硫化氫對代謝性疾病的預防和治療作用的研究也廣泛展開，例如硫化氫

4、對高血壓的作用，對動脈粥樣硬化的改善已經(jīng)取得了可喜的結果。硫化氫對腎臟損傷的研究也已開展了大量的研究，例如在急性腎損傷中，硫化氫對腎臟損傷的保護作用研究。然而，硫化氫對肥胖引起的慢性腎功能損傷是否具有保護作用還不清楚[5-7]。為此，我們首先用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠誘導肥胖，建立腎損傷模型，然后再給予硫化氫，檢測腎功能；腎損傷的發(fā)生常伴著炎癥反應，為此，我們檢測炎癥因子和NF-κB信號途徑，研究炎癥因子在慢性腎損傷中的作用。
　　目的：

5、⑴建立肥胖引起的小鼠慢性腎臟損傷模型；⑵確定硫化氫對肥胖誘導的小鼠慢性腎損傷具有抗炎作用；⑶分析硫化氫對肥胖誘導小鼠慢性腎損傷的保護作用機制。
　　方法：①所有的動物實驗都是根據(jù)河南大學動物保護協(xié)會和倫理委員會的道德準則進行的。8周齡C57BL/6雄性實驗小鼠是從南京大學模式動物研究所購買，在河南大學醫(yī)學院分子醫(yī)學實驗室的動物飼養(yǎng)中心，適應性喂養(yǎng)一周，進行分組(低脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)組)造模和硫氫化鈉（Sodium Hydrosul

6、fide，NaHS，H2S的供體）治療。②小鼠經(jīng)腹腔內注射治療后，每隔2日檢查一次小鼠的狀況，如覓食、運動程度、精神狀態(tài)、皮毛光澤度等情況，并每周監(jiān)測小鼠體重和進食、進水量的變化，實驗結束時進行OGTT檢測，然后處死小鼠，收集血液和組織材料，分別冷凍或固定保存。③小鼠血漿用Cobas8000羅氏全自動生化免疫血清工作站檢測分析，主要檢測血漿血液中的半胱氨酸酶抑制劑（又叫胱抑素C，Cys C），尿素（Urea），肌酐（Creatinine

7、），甘油三酯（TG），總膽固醇（TC），高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C）。然后利用ELISA方法檢測KIM-1指標。④利用ELISA方法檢測血清TNF-α和KIM-1指標，檢測腎組織勻漿液中的TNF-α、KIM-1、IL-6、MCP-1、IL-10的含量。檢測組織中的甘油三脂（TG）和總蛋白（TP），計算出腎臟中TG/TP的含量及變化。⑤小鼠經(jīng)用1-3％戊巴比妥鈉鹽針劑麻醉后，先進行心臟取血，收集血液，接著取出活體

8、組織。腎臟組織進行石蠟切片，切片經(jīng)蘇木精—伊紅染色法( Hematoxylin- eosin staining，HE)染色和PAS（Periodic Acid-Schiff）染色，以及使用Masson染色，觀察腎臟組織損傷，腎小管損傷以及腎小球基底膜變化情況等。⑥取冰凍腎臟組織，提取總的RNA，用RT-PCR進行檢測硫化氫合成酶CBS、CSE、3-MST的mRNA表達變化，檢測TNF-α、IL-6、MCP-1、KIM-1、IL-10等在

9、腎臟中的基因表達情況。⑦用RIPA裂解腎臟組織，用BCA法進行總蛋白定量檢測。Western Blot檢測腎臟組織中NF-κB亞基p50/p65和磷酸化的p65的蛋白含量，以及TNF-α蛋白表達水平。
　　結果：⑴持續(xù)4周腹腔內注射硫氫化鈉溶液治療后，與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的體重減少。⑵持續(xù)4周腹腔內注射硫氫化鈉溶液治療后：與LFD+NS組相比，HFD+NS組小鼠的血漿中Cys C、KIM-1、TG、TC含量

10、明顯升高、HDL-C含量降低；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的血漿中Cys C、KIM-1、TG、TC含量降低、HDL-C含量升高；血尿素、血肌酸酐四組兩兩相比無明顯差異。⑶持續(xù)4周腹腔內注射硫氫化鈉溶液治療后，與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的腎小球體積變小，鮑曼氏腔隙變寬，腎小球局灶結節(jié)化等病理變化都有所好轉。⑷持續(xù)4周腹腔內注射硫氫化鈉溶液治療后：與LFD+NS組相比，HFD+NS組的小鼠腎組織中TNF-

11、α、IL-6、MCP-1的含量升高，RNA表達水平增加；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的腎臟中TNF-α、IL-6、MCP-1的含量降低，基因表達水平下降，IL-10的分泌量增加和基因表達水平升高；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組的p65/p50的蛋白表達含量減少，同時TNF-α的蛋白表達含量下降。
　　結論：硫化氫可以通過下調p50和p65以及PhosPho-p65的蛋白表達，抑制炎癥細胞因子TNF-α和I