硫化氫抗l-NAME所致大鼠肝臟損傷作用及機制的研究.pdf

1、研究H2S對于肝臟的作用，應用L-NAME導致的高血壓大鼠模型除了表現為血壓升高外還伴隨著血清脂質和脂蛋白的異常。如能探明在肝臟中H2S與NO的關系以及內源性H2S水平與心血管疾病危險因素的關系，則可對心血管疾病的防治提供新的思路。
　　本文主要分三部分展開研究：
　　第一部分 硫化氫抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷和心血管風險
　　目的:通過復制亞硝基左旋精氨酸(NG-nitro-L-arginine methyle

2、ster，L-NAME)誘導的大鼠模型并外源性給予H2S的供體硫氫化鈉(NaHS，sodium hydrosulfide)和格列苯脲（glibenclamide，Gli，KATP通道阻斷劑），以研究H2S對L-NAME所致的大鼠肝損傷的保護作用和心血管風險。
　　方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，動物隨機分為6組，分別為:對照（con組），L-NAME組，con+格列苯脲組（con+Gli組），con+硫氫化鈉

3、組（con+NaHS組），L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組，每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉（56μmol/kg）每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。各組大鼠每周測量尾動脈收縮壓。大鼠給予處理5周后，留取血清和肝臟組織測量血清甘油三脂(TG，triglycerides)，高

4、密度脂蛋白(HDE，high-density lipoprotein)，低密度脂蛋白(LDL，low-density lipoprotein)，總膽固醇(CHO total cholesterol)，谷丙轉氨酶(ALT，glutamic-pyruvic transaminase);通過顯微鏡觀察肝組織細胞排列，組織學結構穩(wěn)定程度，門管區(qū)結構，脂肪空泡出現和淋巴細胞浸潤等。
　　結果:1.與con組大鼠相比，各組大鼠的食物攝入量和水

5、的攝入量和體重隨實驗周數逐漸增加，組間差異無統(tǒng)計學意義。各組大鼠均未出現嚴重疾病、死亡的情況。
　　2.在給予處理前各組的尾動脈收縮壓無統(tǒng)計學差異。在給予處理后，L-NAME組大鼠的尾動脈收縮壓逐漸升高，L-NAME+NaHS組血壓較L-NAME組顯著降低。L-NAME+NaHS+Gli組血壓較L-NAME+NaHS組血壓升高，與L-NAME組比較無統(tǒng)計學差異。
　　3.血清CHO和ALT各組之間沒有統(tǒng)計學差異。con組，c

6、on+NaHS組，con+Gli組的LDL和TG含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組LDL和TG較con組明顯升高，L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的LDL和TG較L-NAME組比明顯降低，但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。con組，con+NaHS組，con+Gli組的HDL含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組HDL較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組,L-NAME+NaHS+Gli組的HDL較L

7、-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　4.肝臟組織HE染色后鏡下可見con組，con+NaHS組，con+Gli組肝小葉結構清晰、完整，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀整齊排列。L-NAME組肝小葉結構紊亂，纖維結締組織增生，部分肝細胞體積增大、胞漿內可見大小不等圓形空泡，部分肝細胞可見氣球樣變;中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤。L-NAME+NaHS組和L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織病理學變

8、化介于con組和L-NAME組之間。
　　結論:本研究證實應用NO合酶抑制劑L-NAME造成大鼠血壓的升高、肝臟的損傷和血清肝臟功能相關指標的變化。應用H2S的供體NaHS可以降低L-NAME誘導的大鼠血壓的升高并保護其肝臟的損傷，下調血壓的作用可以被KATP通道的阻斷劑格列苯脲阻斷，但苯脲阻斷不能阻斷H2S對肝臟的保護作用。
　　第二部分 硫化氫通過調節(jié)eNOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷
　　目的:復制

9、L-NAME誘導的大鼠模型并外源性給予H2S的供體NaHS和格列苯脲(Gli)，通過檢測血漿中NO和H2S以及使用分子生物學技術研究H2S保護L-NAME所致的大鼠肝臟損傷的作用機制。
　　方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，動物隨機分為6組，分別為:對照（con組），L-NAME組，con+格列苯脲組（con+Gli組），con+硫氫化鈉組（con+NaHS組），L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS

10、+Gli組，每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉（56μmol/kg）每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。大鼠給予處理5周后，留取血漿和肝臟組織測量血漿H2S的含量，測量肝組織中NO的含量，Western blot法檢測肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177, AKT，P-AKTs473蛋白表達。

11、r>　　結果:1.血漿H2S含量的變化:con組，con+NaHS組，con+Gli組的血漿H2S含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組血漿H2S較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的血漿H2S較L-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　2.肝臟組織NO的變化:con組，con+NaHS組，con+Gli組的肝臟組織NO含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組肝臟組織

12、NO較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織NO分別較L-NAME組比明顯升高，兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　3.肝臟組織蛋白表達:結果采用目的蛋白的灰度值與內部參照GADPH作比較。con組，con+NaHS組，con+Gli組的肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達各組之間均沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組肝臟組織eNOS，P-eNOSs117

13、7，AKT，P-AKTs473蛋白表達均較con組明顯降低。L-NAME+NaHS組，L-NAME+NaHS+Gli組的肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達均較L-NAME組比明顯升高，但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論:本研究證實應用NO合酶的抑制劑L-NAME大鼠血漿H2S和NO含量降低，下調了肝臟組織eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白的表達。應用H2S的

14、供體NaHS可以上調L-NAME誘導的大鼠血漿H2S和NO含量，上調肝臟中與NO合成相關蛋白的表達。這種調節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷，即不是通過KATP通道發(fā)揮的作用，可能是通過激活AKT-eNOS通路起到的。
　　第三部分 硫化氫通過調節(jié)eNOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝細胞損傷
　　目的:通過體外培養(yǎng)原代肝細胞實驗，來探討H2S體外應用是否可通過直接調節(jié)eNOS/AKT途徑而保護L-NAME所致的大鼠肝細胞損傷即通

15、過調節(jié)eNOS/AKT的磷酸化上調肝臟細胞一氧化氮的生成。
　　方法:肝臟細胞的分離和培養(yǎng)參Sprague-Dawley雄性大鼠通過門靜脈灌流消化液方法分離肝臟細胞，并采用臺盼藍排斥法測定肝細胞活力。選取細胞活率在90％以上的肝細胞進行培養(yǎng)。肝臟原代細胞分為對照組(con組),con+NaHS(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)+NaHS(100μmol/L)組，L-N

16、AME(100μmol/L)+NaHS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組，L-NAME(100μmol/L)+NaHS（100μmol/L）+LY294002(20μmol/L)組。藥物作用時間均為8小時。收集細胞培養(yǎng)基上清檢測NO的含量，采用NO的特異性熒光探針DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2'，7'-difluorescein,diacetate)測量細胞內NO的變化，weste

17、rn blot法檢測肝臟原代細胞中eNOS，P-eNOSs1177，AKT，P-AKTs473蛋白表達。
　　結論:本研究證實應用NO合酶抑制劑L-NAME后大鼠肝臟原代細胞NO生成減少，此作用是通過下調肝臟細胞P-eNOSs1177，P-AKTs473蛋白的表達即減低了eNOS，AKT的磷酸化。應用H2S的供體NaHS可以上調肝臟原代細胞NO的生成和相關蛋白的表達。這種調節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷，可以被AKT的阻斷劑LY2940