硫化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭，主要表現(xiàn)為頑固性呼吸困難、低氧血癥、肺順應(yīng)性降低等。細(xì)菌感染所致的膿毒血癥是引起ALI的主要原因，革蘭氏陰性菌(gramnegative bacterium，G-)細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是主要的致病因素，利用LPS復(fù)制ALI的動(dòng)物模型進(jìn)行研究是科研工作中的常用手

2、段之一。 內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)主要由半胱氨酸等含硫氨基酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)作用下生成，它對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)特別是海馬的功能具有調(diào)節(jié)作用，并可以調(diào)節(jié)消化道和血管平滑肌的張力。隨著對(duì)H2S研究的逐漸深入，越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)它參與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是繼一氧化氮

3、(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbonmonoxide，CO)之后的一種新型氣體信使分子。本實(shí)驗(yàn)首先觀察了在內(nèi)毒素性ALI病程中H2S和CSE的時(shí)程性變化，在此基礎(chǔ)上分別給予H2S供體氫硫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)和CSE抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)，觀察它們對(duì)肺組織氧化應(yīng)激、炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞凋亡和肺表面活性物質(zhì)(pulmoalverola

4、r surfactant，PS)等方面的影響，從細(xì)胞、基因、蛋白水平多層次、多方面探討H2S在肺損傷中的作用及機(jī)制，為臨床治療肺損傷提供理論依據(jù)。 第一部分 LPS致大鼠急性肺損傷硫化氫/胱硫醚-γ-裂解酶體系的變化 目的：觀察大鼠內(nèi)毒素性ALI過(guò)程中自介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)和H2S/CSE體系的時(shí)程性變化及關(guān)系，探討LPS誘導(dǎo)ALI的發(fā)病機(jī)制。 方法：健康雄性SD大鼠(270±20

5、g)共80只，隨機(jī)分為6組，Ⅰ空白對(duì)照組；Ⅱ LPS 1h組；ⅢLPS 3h組；ⅣLPS 6h組；ⅤLPS 9h組；ⅥLPS 12h組，空白對(duì)照組共40只(不同時(shí)間點(diǎn)各8只)。用20％的烏拉坦(5ml/kg)麻醉大鼠，LPS 1h、3h、6h、9h和12h組舌靜脈注射LPS(5 mg/kg)。分別于給藥1h、3h、6h、9h及12h后采集樣品；檢測(cè)肺系數(shù)和肺濕/干重比的變化；去蛋白法檢測(cè)血漿中H2S含量、亞甲基藍(lán)法檢測(cè)肺組織CSE活性、

6、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β和IL-10的變化；光鏡、電鏡觀察肺組織病理變化。 結(jié)論：大鼠靜脈注射LPS后，1h時(shí)肺組織未出現(xiàn)明顯損傷，但炎性細(xì)胞因子顯著升高。給予LPS 3h至12h時(shí)均存在肺損傷，IL-1β和IL-10均明顯升高，內(nèi)源性H2S和CSE均明顯降低。IL-1β、IL-10和H2S/CSE體系可能參與內(nèi)毒素性ALI的病理生理過(guò)程。 第二部分硫化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷組織氧化應(yīng)激的影響

7、 目的：觀察H2S對(duì)大鼠內(nèi)毒素性ALI組織過(guò)氧化物和抗氧化物酶的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為I空白對(duì)照組；Ⅱ LPS組；ⅢLPS+NaHS低劑量組；ⅣLPS+NaHS中劑量組；VLPS+NaHS高劑量組；ⅣLPS+PPG組。用20％的烏拉坦(5 ml/kg)麻醉大鼠，LPS組舌靜脈注射LPS，LPS+NaHS低、中、高劑量組分別于舌靜脈注射

8、LPS 3h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS，LPS+PPG組于舌靜脈注射LPS 3h時(shí)腹腔注射30 mg/kg的PPG，空白對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6h時(shí)處死。分別測(cè)定各組大鼠肺系數(shù)和肺濕/干重比的變化；去蛋白法測(cè)定血漿中H2S含量、亞甲基藍(lán)法測(cè)定肺組織CSE活性、硫代巴比妥酸法測(cè)定肺組織丙二醛(MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肺組織超氧化物歧

9、化酶(SOD)活性和酶促反應(yīng)谷胱甘肽消耗法測(cè)定肺組織谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)活性；光鏡、電鏡觀察肺組織病理變化。 結(jié)論：ALI早期應(yīng)用NaHS后，CSE活性增強(qiáng)，H2S生成增加，肺系數(shù)和肺濕/干重比降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA生成減少，抗過(guò)氧化物酶SOD和GSH-Px活性增強(qiáng)，肺損傷減輕。而應(yīng)用PPG后，CSE活性降低，H2S生成減少，肺系數(shù)和肺濕/干重比升高，MDA生成增加，SOD活性降低，肺損傷加重。 第三部分硫

10、化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷組織炎癥細(xì)胞因子的影響 目的：觀察H2S對(duì)大鼠內(nèi)毒素性ALI組織炎癥細(xì)胞因子、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和粘附分子的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為I空白對(duì)照組；IILPS組；IIILPS+NaHS低劑量組；IVLPS+NaHS中劑量組；VLPS+NaHS高劑量組；VILPS+PPG組。用20％的烏拉坦(5 ml/kg)麻醉大鼠，

11、LPS組舌靜脈注射LPS，LPS+NaHS低、中、高劑量組分別于舌靜脈注射LPS 3h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS，LPS+PPG組于舌靜脈注射LPS 3h時(shí)腹腔注射30 mg/kg的PPG，空白對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6 h時(shí)處死。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中IL-1β和IL-10含量；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)定

12、肺組織中IL-1β、IL-10和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA基因表達(dá)；凝膠遷移電泳(EMSA)法測(cè)定核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子-kBp65(NF-kBp65)的活性。 結(jié)論：ALI早期給予NaHS后，IL-1β和ICAM-1 mRNA基因表達(dá)及NF-kBp65活性減弱，IL-10 mRNA基因表達(dá)增強(qiáng)，肺損傷減輕；而給予PPG后，IL-1β和ICAM-1 mRNA基因表達(dá)及NF-kBp65活性增強(qiáng)，IL-10mRNA基因表達(dá)減弱

13、，肺損傷加重。 第四部分硫化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷組織細(xì)胞凋亡的影響 目的：觀察H2S對(duì)大鼠內(nèi)毒素性ALI組織細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為I空白對(duì)照組；ⅡLPS組；ⅢLPS+NaHS低劑量組；IVLPS+NaHS中劑量組；VLPS+NaHS高劑量組；VILPS+PPG組。用20％的烏拉坦(5 ml/kg)麻醉大鼠，LP

14、S組舌靜脈注射LPS，LPS+NaHS低、中、高劑量組分別于舌靜脈注射LPS 3 h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS，LPS+PPG組于舌靜脈注射LPS3 h時(shí)腹腔注射30 mg/kg的PPG，空白對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6 h時(shí)處死。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)肺細(xì)胞凋亡；免疫組化法檢測(cè)肺組織Bcl-2和Bax的表達(dá)；Western blott

15、ing法檢測(cè)肺組織Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。 結(jié)論：ALI早期給予NaHS后，肺細(xì)胞凋亡率降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，肺損傷減輕；給予PPG后，肺細(xì)胞凋亡率升高，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，肺損傷加重。 第五部分硫化氫對(duì)大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷肺泡表面活性物質(zhì)的影響 目的：觀察H

16、2S對(duì)大鼠內(nèi)毒素性ALI肺泡表面活性物質(zhì)(PS)的影響，探討其作用機(jī)制。 方法：健康成年雄性SD大鼠(270±20 g)共48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為I空白對(duì)照組；ⅡLPS組；ⅢLPS+NaHS低劑量組；ⅣLPS+NaHS中劑量組；Ⅴ LPS+NaHS高劑量組；ⅥLPS+PPG組。用20％的烏拉坦(5 ml/kg)麻醉大鼠，LPS組舌靜脈注射LPS，LPS+NaHS低、中、高劑量組分別于舌靜脈注射LPS 3 h時(shí)腹腔注

17、射0.78 mg/kg、1.56mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS，LPS+PPG組于舌靜脈注射LPS 3 h時(shí)腹腔注射30 mg/kg的PPG，空白對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6 h時(shí)處死。應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定肺組織中肺泡表面活性蛋白-A、B、C(SP-A、B、C)mRNA基因表達(dá)的變化；測(cè)定各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白(TP)和總磷脂(TPL)含量的變化。 結(jié)論：AL