硫化氫對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷肺細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、本研究擬采用透射電鏡、Western blotting及基因檢測(cè)等技術(shù)，在線粒體水平，從形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)、基因表達(dá)等方面觀察H2S對(duì)LPS致大鼠ALI肺組織細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。并進(jìn)一步評(píng)價(jià)NaHS對(duì)LPS所致ALI/ARDS的治療作用。進(jìn)而為ALI/ARDS的治療提供新的思路。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 脂多糖致大鼠急性肺損傷內(nèi)源性硫化氫/胱硫醚-γ-裂解酶系統(tǒng)的改變
　　目的:觀察LPS血癥致

2、大鼠ALI過程中H2S/CSE系統(tǒng)的時(shí)程性變化及關(guān)系。
　　方法:選用雄性健康SD大鼠(280±20g)隨機(jī)分為五組:①對(duì)照組;②LPS1 h組;③LPS3 h組;④LPS6 h組;⑤LPS9h組。對(duì)照組共32只，不同時(shí)間點(diǎn)各8只。腹腔注射10％水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，LPS1h、3h、6h和9h組舌靜脈注射LPS（5 mg/kg）。分別于給藥后1h、3h、6h和9h后采集各樣品;檢測(cè)肺系數(shù)及肺濕/干重比的變化;酶聯(lián)免

3、疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β的變化;去蛋白法檢測(cè)血漿中H2S含量、亞甲基藍(lán)法檢測(cè)肺組織CSE活性;電鏡觀察肺組織病理變化。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)照組大鼠肺系數(shù)在1h～9h之間未見明顯變化。
　　2.在1h～9h之間，對(duì)照組大鼠肺濕/干重比未見明顯變化。
　　3.在1h～9h之間，對(duì)照組大鼠血清IL-1β濃度未見明顯變化。
　　4.在1h～9h之間，對(duì)照組大鼠血漿，H2S含量未見明顯變化。

4、r>　　5.在1h～9h之間，對(duì)照組大鼠血漿，肺組織CSE活性未見明顯變化。
　　6.透射電鏡下可見，對(duì)照組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞呈立方形，表面微絨毛排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞核大且呈橢圓形核膜完整;嗜鋨性板層小體結(jié)構(gòu)基本正常;線粒體結(jié)構(gòu)正常。
　　結(jié)論:大鼠在舌靜脈注射LPS1 h時(shí)，尚未出現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)受損及肺水腫，但血清中炎癥細(xì)胞因子IL-1β已明顯增高。舌靜脈注射LPS3 h、6h、9h后肺損傷明顯加重，IL-1β

5、先增后降，H2S/CSE系統(tǒng)明顯下調(diào)。提示H2S/CSE系統(tǒng)及IL-1β可能均參與了LPS致ALI的病生理過程。
　　第二部分 硫化氫對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷肺組織細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察H2S對(duì)LPS致大鼠ALI肺細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:選用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為①對(duì)照組;②LPS損傷組;③LPS+低劑量NaHS組;④LPS+中劑量NaHS組;⑤LPS+高

6、劑量NaHS組。腹腔注射10％水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，LPS損傷組舌靜脈注射LPS（5 mg/kg），LPS+低、中、高劑量NaHS組分別于舌靜脈注射LPS(5 mg/kg)3 h時(shí)腹腔注射0.78mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS（均為2 ml/kg，用前半小時(shí)生理鹽水新鮮配置），對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6h時(shí)處死。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)肺組織細(xì)

7、胞的凋亡。
　　結(jié)果:對(duì)照組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率為21.81±2.17％，與對(duì)照組比較，LPS損傷組大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡率明顯增高(P＜0.01);與LPS損傷組比較，LPS+低、中、高劑NaHS量組大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡率明顯減低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:LPS所致大鼠ALI肺組織細(xì)胞凋亡率明顯增加，給予NaHS后，肺組織細(xì)胞凋亡率明顯降低，并呈劑量依賴關(guān)系。
　　第三部分 硫化氫對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷肺組織細(xì)胞

8、凋亡相關(guān)因子的影響
　　目的:觀察H2S對(duì)LPS致大鼠急性肺損傷肺組織細(xì)胞凋亡因子的影響。
　　方法:選用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為①對(duì)照組;②LPS損傷組;③LPS+低劑量NaHS組;④LPS+中劑量NaHS組;⑤LPS+高劑量NaHS組。腹腔注射10％水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，LPS損傷組舌靜脈注射LPS(5 mg/kg)，LPS+低、中、高劑量NaHS組分別于舌

9、靜脈注射LPS(5 mg/kg)3 h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS（均為2ml/kg，用前半小時(shí)生理鹽水新鮮配置），對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6h時(shí)處死。應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)肺組織caspase-3、caspase-9，bcl-2、bax，Smac/DIABLO的表達(dá)變化。通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)肺組織casp

10、ase-3、caspase-9，bcl-2、bax，Smac/DIABLO基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.肺臟組織caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的變化。
　　2.肺臟組織bcl-2和bax蛋白的表達(dá)變化。
　　3.肺臟組織Smac/DIABLO蛋白的表達(dá)變化。
　　4.肺臟組織caspase-3、caspase-9 mRNA的表達(dá)變化。
　　5.肺臟組織bcl-2、bax mRN

11、A的表達(dá)變化。
　　6.肺臟組織Smac/DIABLO mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)論:LPS導(dǎo)致ALI給予NaHS，caspase-3、caspase-9、bax及Smac/DIABLO蛋白表達(dá)減弱，bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，caspase-3、caspase-9、bax及Smac/DIABLO mRNA表達(dá)減弱，bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，肺組織細(xì)胞凋亡降低。
　　第四部分 硫化氫對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷線粒體凋亡

12、相關(guān)途徑的影響
　　目的:觀察H2S對(duì)LPS致大鼠ALI線粒體凋亡途徑的影響。
　　方法:選用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為①對(duì)照組;②LPS損傷組;③LPS+低劑量NaHS組;④LPS+中劑量NaHS組;⑤LPS+高劑量NaHS組。腹腔注射10％水合氯醛350 mg.kg-1麻醉大鼠，LPS損傷組舌靜脈注射LPS（5 mg/kg），LPS+低、中、高劑量NaHS組分別于舌靜脈注射

13、LPS（5 mg/kg）3h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS（均為2 ml/kg，用前半小時(shí)生理鹽水新鮮配置），對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6h時(shí)處死，迅速取出肺組織，勻漿器混勻后，各組分別提取細(xì)胞胞漿蛋白及線粒體蛋白、定量，應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)肺組織胞漿及線粒體內(nèi)CytC及AIF的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.肺臟

14、組織胞漿內(nèi)及肺組織線粒體內(nèi)CytC蛋白表達(dá)的變化。
　　2.肺臟組織胞漿內(nèi)及肺組織線粒體內(nèi)AIF蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)論:在LPS導(dǎo)致ALI給予NaHS，大鼠肺臟組織胞漿內(nèi)CytC蛋白及AIF蛋白的表達(dá)明顯減弱，線粒體內(nèi)CytC蛋白及AIF蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，肺組織細(xì)胞凋亡降低。
　　第五部分 硫化氫對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷肺組織細(xì)胞線粒體的影響
　　目的:觀察H2S對(duì)LPS致大鼠ALI肺臟線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影

15、響。
　　方法:選用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為①對(duì)照組;②LPS損傷組;③LPS+低劑量NaHS組;④LPS+中劑量NaHS組;⑤LPS+高劑量NaHS組。腹腔注射10％水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，LPS損傷組舌靜脈注射LPS(5 mg/kg)，LPS+低、中、高劑量NaHS組分別于舌靜脈注射LPS(5 mg/kg)3 h時(shí)腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和

16、3.12 mg/kg的NaHS（均為2 ml/kg，用前半小時(shí)生理鹽水新鮮配置），對(duì)照組舌靜脈注射等容量的生理鹽水。各組大鼠均于給予LPS或生理鹽水6h時(shí)處死，迅速取出肺組織，勻漿器混勻后，低溫差速離心法提取肺臟組織線粒體，測(cè)定線粒體總ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量及線粒體腫脹度、活力;電鏡觀察大鼠肺臟組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.透射電鏡下

17、肺臟組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。
　　2.肺組織細(xì)胞線粒體MDA含量、SOD、GSH-Px和ATPase活性的變化。
　　3.肺組織細(xì)胞線粒體活力和線粒體膜腫脹度的變化
　　與對(duì)照組比較，LPS損傷組大鼠肺臟組織細(xì)胞線粒體膜腫脹度明顯增高（OD540值明顯減低），線粒體活力明顯減低(P＜0.01)。與LPS損傷組比較，LPS+低、中、高劑量NaHS組大鼠肺臟組織細(xì)胞線粒體膜腫脹度明顯減低（OD540值明顯增加），線粒體活力明