硫化氫對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響.pdf

1、硫化氫對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響硫化氫對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響神經(jīng)病學(xué)研究生：魯文導(dǎo)師：吳珊朱筑霞摘要:目的：探討硫化氫對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響，了解硫化氫在砷的神經(jīng)毒性中的保護(hù)作用。方法：原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分成三大組：對(duì)照組（未染毒組，簡(jiǎn)稱(chēng)O組）；亞砷酸鈉組（NaAsO2組，簡(jiǎn)稱(chēng)S組）：在細(xì)胞培養(yǎng)基中加77μmolL亞砷酸鈉；不同濃度的硫氫化鈉（NaHS）亞砷酸鈉組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同

2、濃度的NaHS，NaHS濃度分別為100、150、200、250、300、350μmolL，同時(shí)均加入77μmolL的亞砷酸鈉（NaAsO2），分別簡(jiǎn)稱(chēng)N1、N1、N2、N3、N4、N5、N6組。（1）按上述分組處理方法培養(yǎng)24h和48h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清的微量丙二醛（MDA）的含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)的活性、超氧化物歧化酶(SOD)的活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性以及乙酰膽堿酯酶(TC

3、HE)的活性的改變。（2）檢測(cè)H2S對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)源性H2S的含量變化。（3）檢測(cè)H2S對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成相關(guān)的胱硫醚β合酶（CBS）含量的變化。結(jié)果：1、不同濃度H2S和一定濃度砷作用于原代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞24h和48h后，砷可導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞胞體邊界模糊不清，突起變短減少，偶見(jiàn)突起網(wǎng)狀交織，隨著作用的時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重；而H2S濃度在100200umolL時(shí)可拮抗砷對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷，但

4、超過(guò)H2S超過(guò)200umolL時(shí)則表現(xiàn)為毒性損傷加重。2.與對(duì)照組（O組）比較，亞砷酸鈉組（S組）海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的微量丙二醛（MDA）的含量明顯升高，過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）的活性、超氧化物歧化酶(SOD)的活性、乙酰膽堿酯酶(TCHE)的活性明顯降低；與亞砷酸鈉組（S組）比較，N1N3組MDA的含量、CAT的活性、GSHPX的活性、SOD的活性、TCHE的活性組間均有顯著差異(P005)，N

5、1N3組MDA含量降低，其中尤以N3組MDA含量降低明顯，N1N3組CAT的活性、GSHPX的活性、SOD的活性、TCHE的活性升高，其中尤以N3組CAT的活性、GSHPX的活性、SOD的活性、TCHE的活性升高明顯，且N3組與除O組外的各實(shí)驗(yàn)組比較MDA的含量、CAT的活性、GSHPX的活性、SOD的活性、TCHE的活性組間均有顯著差異(P0.05)。3、與O組（對(duì)照組）比較，S、N1、N3、N4組細(xì)胞內(nèi)源性H2S含量明顯降低(P0.

6、05)；與S組比較，N1、N3、有抗氧化損傷的作用[14]。然而，長(zhǎng)久以來(lái)，人們對(duì)于硫化氫的認(rèn)識(shí)僅限于它的毒性作用。直到上個(gè)世紀(jì)90年代中期Abe[15]等首次證實(shí)，硫化氫是一種新型的重要的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)，是繼一氧化碳（carbonmonoxide，CO）和一氧化氮(nitricoxide，NO)之后被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子[16]，在體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)中廣泛存在。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，胱硫醚β合酶(cystathioninebetasyntha

7、seCBS)和胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγlyaseCSE)是生成內(nèi)源性硫化氫有關(guān)的兩個(gè)主要的酶[1718]，其中胱硫醚β合酶（CBS）是大腦中合成硫化氫的主要酶，主要分布在海馬、小腦、皮層和腦干等部位[171921]。用硫化氫的供體硫氫化鈉（sodiumhydrosulfide，NaHS）預(yù)處理創(chuàng)傷性腦損傷的小鼠，可減輕創(chuàng)傷性腦損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，表明硫化氫可能有拮抗神經(jīng)元損傷的潛力[22]。體內(nèi)含硫氨基酸代謝產(chǎn)生的硫

8、化氫對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)，特別是海馬的功能具有調(diào)節(jié)作用[2325]，從而開(kāi)啟了人們對(duì)硫化氫生理作用認(rèn)識(shí)的新視角。針對(duì)硫化氫是體內(nèi)生理性調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)的氣體遞質(zhì)，對(duì)細(xì)胞又具有抗氧化損傷的作用[14]，而砷對(duì)細(xì)胞的直接毒性機(jī)制主要是通過(guò)氧化損傷發(fā)揮作用，因此本研究以砷中毒的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞為模型，探討硫化氫對(duì)砷致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響，了解硫化氫對(duì)砷中毒神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，為砷的神經(jīng)毒性提供預(yù)防和治療的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.材料與方法1.1實(shí)

9、驗(yàn)動(dòng)物新生Wistar大鼠（24h）由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供批號(hào)ISCXK（黔）2012001。1.2主要試劑和儀器1.2.1主要試劑HycloneDMEMF121：1細(xì)胞培養(yǎng)液、L多聚賴(lài)氨酸、胎牛血清，阿糖胞苷（5）、雙抗、硫氫化鈉、亞砷酸鈉、微量丙二醛（MDA）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GHSPX）測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒，、乙酰膽堿酯酶（TCHE）測(cè)試盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、R