硫化氫對(duì)PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NMDA受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是一種有著各種精神方面癥狀的精神障礙，每個(gè)PTSD患者都經(jīng)歷了對(duì)自己生命有著威脅的事件或者遭受過很嚴(yán)重的傷害。到現(xiàn)在為止，PTSD的發(fā)病機(jī)制還未完全明確，神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)可能是引起憂慮，焦急和多因素性恐慌的神經(jīng)基礎(chǔ)。
　　近年來多項(xiàng)研究都顯示H2S是繼一氧化氮、一氧化碳后第三種氣體信號(hào)分子，存在于中樞神經(jīng)、心血管和內(nèi)臟等許多

2、組織，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。由于內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)等酶的催化產(chǎn)生的，所以，H2S的表達(dá)受這些酶的調(diào)控。而在神經(jīng)系統(tǒng)中的小腦、海馬、皮質(zhì)等部位，大量分布著CBS，其中，海馬中CBS的含量比較高。
　　N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic aci

3、d receptor，NMDAr)是離子型受體，它能調(diào)節(jié)生物體內(nèi)神經(jīng)元的活性、神經(jīng)的結(jié)構(gòu)發(fā)育和突觸可塑性、對(duì)生物體的發(fā)育過程有重要作用。NMDA受體在體內(nèi)活性調(diào)節(jié)的不平衡可能是老年癡呆、癲癇和帕金森等許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)PTSD大鼠H2S含量和相關(guān)蛋白CBS蛋白的表達(dá)變化，及應(yīng)用外源性H2S，觀察上述因素的變化與NMDA蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性，探討兩個(gè)信號(hào)通路在PTSD過程中是否以及如何發(fā)揮作用，為P

4、TSD的進(jìn)一步研究提供科研依據(jù)。
　　方法：
　　一、PTSD大鼠模型制備與實(shí)驗(yàn)分組
　　成年SD雄性大鼠(200±12g)，在室溫下禁錮2h后，馬上進(jìn)行強(qiáng)迫游泳20min（深400mm，溫25℃）。然后晾干15min以后，進(jìn)行乙醚麻醉。
　　將SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、SPS、SPS+NaHS、SPS+NaCl組。
　　模型制備后給予SPS+NaHS組腹腔注射NaHS（5mg/kg，溶于0.5gN

5、aCl中），SPS+NaCl組腹腔注射NaCl(0.9％，0.5g)，7天。
　　二、行為學(xué)檢測(cè)
　　各組大鼠分別進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)(open-field，OF)和高架十字迷宮(elevatedplus-maze，EPM)，用來測(cè)試大鼠的行為學(xué)變化。
　　三、取材
　　將各組大鼠麻醉，0.9％NaCl灌注，在冰上斷頭取腦海馬組織，然后-80℃凍存?zhèn)溆?Western Blot);多聚甲醛灌注，在冰上斷頭取腦，4℃?zhèn)溆茫?/p>

6、免疫組化）。四、Western Blot
　　大鼠海馬組織，剪碎裂解半小時(shí)，4℃離心(12000 r/min，30 min)，取上清。進(jìn)行目的蛋白分子量測(cè)定后，電泳(90V，120V)、轉(zhuǎn)膜、封閉，CBS和NMDAR2B一抗孵育（兔抗大鼠多克隆抗體NMDA R2B，1∶1000;兔抗大鼠多克隆抗體CBS，1∶1000），4℃過夜，二抗孵育（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶5000）37℃1h，ECL發(fā)光。內(nèi)參對(duì)照選用抗GAPDH抗體。

7、用來測(cè)定各組大鼠CBS和NMDA蛋白的表達(dá)情況。
　　五、免疫組織化學(xué)
　　大鼠腦組織進(jìn)行冰凍切片，山羊血清封閉，一抗孵育(兔抗鼠多克隆抗體NMDAR2B，1∶1000)4℃過夜，滴加二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液溶液，DAB顯色，脫水透明，中性樹膠封片。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用GraphPad Prim5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。各組CBS和NMDA N

8、R2B的比較采用單因素的方差分析方法。當(dāng)p＜0.05時(shí)表示差異之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果:與空白對(duì)照組相比，SPS組和SPS+NaCl組大鼠在中央停留的時(shí)間、在中央?yún)^(qū)域走動(dòng)的距離均顯著減少;與SPS組和SPS+NaCl組相比，SPS+NaHS組大鼠在中央停留的時(shí)間、在中央?yún)^(qū)域走動(dòng)距離顯著增多，且與空白對(duì)照組無顯著差異。曠場(chǎng)試驗(yàn)1小時(shí)后，對(duì)SPS模型大鼠進(jìn)行高架十字迷宮試驗(yàn)，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比

9、，SPS組和SPS+NaCl組在開放臂停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)顯著減少;與SPS組和SPS+NaCl組相比，SPS+NaHS組在開放臂停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)顯著增加，且與空白對(duì)照組無顯著差異。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，SPS和SPS+NaCl組CBS蛋白和NMDA受體表達(dá)水平顯著降低;與SPS組和SPS+NaCl組相比，SPS+NaHS組CBS蛋白和NMDA受體表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，且與空白對(duì)照組