鈉氫交換體1在內毒素性急性肺損傷中作用的實驗研究.pdf

1、第一部分 鈉氫交換體1在大鼠內毒素性急性肺損傷中的表達
　　 目的：建立大鼠內毒素性急性肺損傷實驗模型，觀察實驗模型中大鼠肺組織上鈉氫交換體1的表達變化情況及其與炎癥的關系。
　　 方法：40只雄性清潔級SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機分成空白對照組（C組）、脂多糖2h組（L-2h組）、脂多糖4h組（L-4h組）和脂多糖6h組（L-6h組），每組各10只。C組大鼠給予股靜脈輸注生理鹽水；L-2h組、L-4h組和

2、L-6h組大鼠均給予股靜脈輸注6mg/kg 脂多糖。實驗開始后2 h 頸動脈放血處死C組和L-2h組大鼠, 4小時和6小時后分別處死L-4h組和L-6h組大鼠。監(jiān)測各組大鼠基本生命體征；光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理改變；計算急性肺損傷評分和肺組織濕/干重比值；檢測支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細胞炎性蛋白的濃度；測定肺組織髓過氧化物酶活性；EMSA檢測肺組織細胞核轉錄因子-Κb的活性；免疫組化、RT-PCR和West

3、ern Blot檢測肺組織鈉氫交換體1Mrna和蛋白的表達水平。
　　 結果：（1）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠平均動脈壓明顯下降（均P＜0.05）、心率和呼吸頻率明顯上升（均P＜0.05）；脂多糖4h組和6h組大鼠動脈血氧分壓顯著下降（均P＜0.05），（2）空白對照組大鼠肺組織肺泡結構正常，肺泡腔無滲出物；脂多糖各組大鼠肺組織病理改變明顯，肺泡間隔增厚，肺泡腔內可見較多的炎性細胞，肺泡腔內有血性滲出液。和空白對照組比較，

4、脂多糖各組大鼠肺組織急性肺損傷評分均明顯增高（P＜0.05）。（3）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織濕/干重比均明顯上升（P＜0.05）；支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細胞炎性蛋白的濃度均明顯增高（均P＜0.05）。（4）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織髓過氧化物酶活性均明顯增高（P＜0.05）。（5）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織核轉錄因子-Κb的活性均明顯增高（P＜0.05）。（6）和空白對照組

5、比較，免疫組化檢測脂多糖各組大鼠肺組織NHE1的表達水平均明顯增高（P＜0.05）。（7）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達水平均明顯增高（P＜0.05）。（8）和空白對照組比較，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1的蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.05）。
　　 結論：以6mg/kg的劑量給予大鼠靜脈注射脂多糖后4h就產生了明顯的急性肺損傷，表現(xiàn)為大鼠基本生命體征的內毒素休克癥狀出現(xiàn)；大鼠大體標本組織

6、學炎癥病理改變；肺組織含水量增加；肺組織及支氣管肺泡灌洗液中相關炎性因子增加；與此同時，脂多糖各組大鼠肺組織鈉氫交換體1Mrna和蛋白的表達水平也隨著急性肺損傷炎癥反應的加重而明顯增加。
　　 第二部分 阿米洛利對大鼠內毒素性急性肺損傷的保護作用
　　 目的：探討阿米洛利預先給藥對脂多糖誘導的大鼠內毒素性急性肺損傷的保護作用及可能機制。
　　 方法：40只雄性清潔級SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機分成空

7、白對照組（C組）、脂多糖組（L組）、阿米洛利組(A組)和阿米洛利預給藥組(AL組)。C組靜脈輸注生理鹽水3ml；L組依次靜脈輸注1ml生理鹽水及2ml脂多糖；A組依次靜脈輸注1ml阿米洛利及2ml生理鹽水；AL組先輸注1ml阿米洛利再輸注2ml脂多糖。靜脈注射脂多糖/阿米洛利6小時后頸動脈放血處死大鼠。光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理改變；計算急性肺損傷評分和肺組織濕/干重比值；測定支氣管肺泡灌洗液中總蛋白的濃度；檢測肺組織髓過氧化物酶活

8、性、丙二醛濃度和超氧化物歧化酶活力；半定量免疫組化法檢測肺組織過氧亞硝酸鹽硝基酪氨酸殘基的含量；RT-PCR檢測肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達水平；Western blot法檢測鈉氫交換體1、細胞外信號調節(jié)激酶及p38絲裂原活化蛋白激酶的蛋白表達水平。
　　 結論：大鼠靜脈注射脂多糖產生急性肺損傷的同時伴隨有肺組織鈉氫交換體1、細胞外信號調節(jié)激酶及 p38絲裂原活化蛋白激酶的顯著激活；鈉氫交換體1抑制劑阿米洛利預先給藥對大鼠內

9、毒素性急性肺損傷有保護作用，其機制可能與抑制細胞外信號調節(jié)激酶的激活有關。
　　 第三部分絲裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利防治大鼠內毒素性急性肺損傷中的作用
　　 目的：探討絲裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利預先給藥防治脂多糖誘導的大鼠內毒素性急性肺損傷中的作用及可能機制。
　　 方法：70只雄性清潔級SD大鼠，體重在250～350g之間，隨機均分成空白對照組（C組）、脂多糖組（L組）、阿米洛利預給藥組(AL組)、

10、PD098059預給藥組(PL組)、SB203580預給藥組(SL組)、 阿米洛利聯(lián)合PD098059預給藥組(APL組)和阿米洛利聯(lián)合SB203580預給藥組(ASL組)。 C組靜脈輸注生理鹽水3ml；L組靜脈輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總容積共3ml；AL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總容積共3ml；PL組先靜脈輸注PD098059(0.3mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)

11、及生理鹽水總容積共3ml；SL組先靜脈輸注SB203580(10mg/kg)再輸注脂多糖(6mg/kg)及生理鹽水總容積共3ml；APL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注PD098059(0.3mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)總容積共3ml；ASL組先靜脈輸注阿米洛利(10mg/kg)再輸注SB203580(10mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)總容積共3ml。實驗開始6小時后頸動脈放血處死大鼠。光學顯微鏡下觀察大鼠肺組

12、織病理改變；計算急性肺損傷評分和肺組織濕/干重比值；測定支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、腫瘤壞死因子-α和巨噬細胞炎性蛋白的濃度；檢測肺組織髓過氧化物酶活性；RT-PCR檢測肺組織鈉氫交換體1Mrna的表達水平; Western blot法檢測鈉氫交換體1的蛋白表達水平。
　　 結論：鈉氫交換體1抑制劑阿米洛利預先給藥對大鼠內毒素性急性肺損傷有保護作用；細胞外信號調節(jié)激酶的阻滯劑可以完全取消阿米洛利的作用，說明阿米洛利防治大鼠內毒素性

13、急性肺損傷的作用機制可能與抑制細胞外信號調節(jié)激酶的激活有關。
　　 第四部分 鈉氫交換體1在脂多糖活化鼠源性巨噬細胞中的表達變化及阿米洛利的作用
　　 目的：觀察鈉氫交換體1Mrna和蛋白在脂多糖活化鼠源性巨噬細胞中的表達變化及阿米洛利預先給藥對它的影響。
　　 方法：傳代培養(yǎng)的鼠源性巨噬細胞株（RAW264.7細胞）以1×106個／ml的密度接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后, 隨機分為4組：僅加RPMI 1640培

14、養(yǎng)液的對照組;加300μM阿米洛利的阿米洛利組; 加1μg/ml 脂多糖的脂多糖組; 加300μM阿米洛利干預30min后再加1μg/ml 脂多糖的阿米洛利預給藥組; 實驗開始24 h后, ELISA法和Griess法分別檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α濃度和一氧化氮的水平、應用細胞內活性氧敏感性熒光探針DCFH-DA檢測各組細胞內活性氧的水平; 實驗開始3h后, 采用逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各組細胞內鈉氫交換體