硫化氫對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后的腦保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、隨著人們生活習(xí)慣和生活環(huán)境的改變，心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高，由此引起的心臟性猝死(SCD)也越來越多。盡管隨著現(xiàn)代心肺復(fù)蘇(CPR)技術(shù)和急診醫(yī)務(wù)人員技術(shù)水平的不斷提高，心臟驟停(CA)患者得到及時(shí)有效的救治，自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)率不斷提高，在一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)可達(dá)到40％～60％，但最終的存活率仍非常低。究其原因，與CA患者在ROSC后特有的病理生理過程密切相關(guān)。本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一部分：經(jīng)皮電刺激心外膜法建

2、立大鼠心臟驟停模型。
　　 目的：通過經(jīng)皮電刺激心外膜的方法建立大鼠心臟驟停(CA)模型。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在中山大學(xué)衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，選擇20只雄性Sprague-Dawley大鼠，兩根經(jīng)皮刺入心外膜的細(xì)針作為電極與刺激器相連，采用直流恒流持續(xù)電刺激3min而誘發(fā)CA，無干預(yù)觀察6min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇(CPR)。
　　 結(jié)果：刺激電流強(qiáng)度1mA時(shí)誘發(fā)CA成功12只，2mA時(shí)全部誘發(fā)成功。從有效電刺激

3、開始到成功誘發(fā)CA的時(shí)間為5.10±2.81s。電刺激結(jié)束時(shí)表現(xiàn)為室顫(VF)的18只，無脈性電活動(dòng)(PEA)2只。CPR用時(shí)207.4±148.8s，自主循環(huán)恢復(fù)率為20/20，CA后4h內(nèi)的死亡率為5/25，72h時(shí)存活率為10/20。有2只大鼠分別并發(fā)輕微肌肉收縮和輕度肺葉損傷。
　　 結(jié)論：經(jīng)皮電刺激心外膜法誘發(fā)大鼠CA具有模型穩(wěn)定、操作簡單、所需刺激電流強(qiáng)度小、并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)，可用于心肺復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究。
　　

4、第二部分：大鼠心肺復(fù)蘇后血清硫化氫濃度變化。
　　 目的：尋找心肺復(fù)蘇后大鼠血清硫化氫(H2S)濃度的變化規(guī)律并探討H2S對(duì)心肺復(fù)蘇(CPR)后病理生理發(fā)展過程中的影響。
　　 方法：將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=24)和對(duì)照組(n=6)，實(shí)驗(yàn)組采用經(jīng)皮電刺激心外膜法建立大鼠心臟驟停(CA)模型，分別于CA前、自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后2、4、6、8、10和12h采血測(cè)定H2S濃度并記錄體溫、平均動(dòng)脈壓、心率和

5、呼吸頻率；對(duì)照組除不予以誘發(fā)CA外，其余處理措施與實(shí)驗(yàn)組相同。分析血清H2S在CPR后的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其與上述生命體征的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)組24只大鼠全部誘發(fā)心臟驟停并復(fù)蘇成功，觀察終點(diǎn)時(shí)(ROSC后12h)有14只大鼠存活且生命體征穩(wěn)定：對(duì)照組無死亡現(xiàn)象。②實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠心肺復(fù)蘇后血清H2S濃度動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)明顯不同(F=12.226,P=0.003)；實(shí)驗(yàn)組大鼠在心肺復(fù)蘇后血清H2S濃度迅速升高，于ROSC后6h

6、時(shí)達(dá)到高峰，然后回落至與對(duì)照組相似的水平。
　　 結(jié)論：在CA/CPR后血清H2S水平有一個(gè)逐漸升高然后回落的動(dòng)態(tài)變化，可能是機(jī)體代償性反應(yīng)的一種表現(xiàn)并參與體溫和血壓等生理過程的調(diào)節(jié)。
　　 第三部分：硫化氫減輕心臟驟停后腦損害。
　　 目的：探討硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是否能減輕心臟驟停(cardiac arrest,CA)后腦損害。
　　 方法：雄性SD大鼠100只，根據(jù)隨機(jī)

7、原則初始選擇60只，均分為3組，其余40只作為備用鼠；另選用性別、鼠齡和體重與之匹配的大鼠100只作為供血鼠。在建立CA/CPR模型后，參照Utstein模式進(jìn)行心肺復(fù)蘇(cardiopulmonaryresuscitation,CPR)。第一組給予硫氫化鈉(14μmol/kg·d)進(jìn)行干預(yù)，第二組給予羥胺(40μmol/kg·d)進(jìn)行干預(yù)，第三組只予以常規(guī)復(fù)蘇。動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清H2S、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific

8、enolase，NSE)與S100β濃度，神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Neurologic deficit scoring，NDS)，Morris水迷宮、走橫木和抓握牽引實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：①各組間造模及備用鼠使用情況的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.374，P=0.829)。②CA/CPR前后血清H2S、NSE和S100β濃度以及NDS變化趨勢(shì)的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第三組CA后血清H2S濃度升高，CPR后4h時(shí)達(dá)到高峰，然后隨

9、CPR后時(shí)間延長而逐漸下降，第一組和第二組在CPR后表現(xiàn)為相應(yīng)的升高或降低。CPR后大鼠血清NSE和S100β濃度逐漸升高，分別于CPR后24h和4h時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸下降；其中第一組峰值最低而第二組峰值最大，在CPR后一定時(shí)間內(nèi)第一組大鼠血清NSE和S100β濃度較低而第二組相對(duì)較高；CA/CPR后大鼠NDS分值明顯下降，在CPR后4h時(shí)最低，然后逐漸升高，其中在CPR后第一組降低的幅度最小而第二組最大；在一定時(shí)間內(nèi)第一組的NDS分

10、值高于第二組。
　　 結(jié)論：H2S參與CA后腦損害的發(fā)生發(fā)展，給予H2S供體可以使腦損害減輕，而抑制內(nèi)源性H2S生成則使腦功能惡化。
　　 第四部分：硫化氫減輕心臟驟停后腦損害的機(jī)制探討。
　　 第一節(jié)：硫化氫抑制大鼠心臟驟停后腦細(xì)胞凋亡。
　　 目的：通過檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況來探討硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在心肺復(fù)蘇后腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 方法：選用健康6-

11、12月、體重300-500 g雄性SD大鼠60只，隨機(jī)均分為3組。在建立CA/CPR模型后，第一組給予硫氫化鈉干預(yù)，第二組給予羥胺干預(yù)，第三組為常規(guī)復(fù)蘇組。在CPR后7天時(shí)檢測(cè)皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和小腦部位細(xì)胞凋亡及Caspase-3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①第一組、第二組和第三組分別有12、11和10只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，三組動(dòng)物轉(zhuǎn)歸情況的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.404,P=0.817)。②在CPR后7天時(shí)血清H2S濃度第一組為

12、9.12±3.17μmol/L，第二組為1.37±0.45μmol/，第三組為3.72±1.05μmol/L L；三組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義F=44.563,P=0.000)。
　　 結(jié)論：H2S參與CA/CPR后腦細(xì)胞凋亡過程，給予外源性H2S供體可以抑制腦細(xì)胞凋亡，而給予內(nèi)源性H2S生成抑制劑則能促進(jìn)腦細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 第二節(jié)：硫化氫對(duì)大鼠心臟驟停后海馬bax和bcl-2表達(dá)的影響。
　　 目的：通過檢

13、測(cè)大鼠海馬組織bcl-2和bax表達(dá)來探討硫化氫(H2S)影響心臟驟停(cardiac arrest，CA)后腦細(xì)胞凋亡的途徑。
　　 方法：雄性SD大鼠160只，初始選擇108只隨機(jī)均分為3組，建立CA/CPR模型。①第一組(36只)：在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后予以NaHS干預(yù)；②第二組(36只)，在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后予以羥胺干預(yù)；③第三組為常規(guī)復(fù)蘇組(36只)。上述三組根據(jù)觀察終點(diǎn)又均分為1天、3天和7天三個(gè)亞組，

14、每個(gè)亞組再等分兩組分別做相關(guān)凋亡的免疫組化和RT-PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果：①三組經(jīng)歷CPR大鼠死亡及備用鼠使用的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②在CPR后，三組之間大鼠血清H2S濃度變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=189.917,P=0.000)。分時(shí)點(diǎn)比較，在CPR后各個(gè)時(shí)點(diǎn)上三組之間血清H2S濃度的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與第三組相比，第一組濃度較高，而第二組濃度較低。
　　 結(jié)論：在CPR后，H2S

15、可能通過促進(jìn)bcl-2和抑制bax表達(dá)來影響bcl-2/bax的平衡而參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。
　　 第三節(jié)：硫化氫影響心肺復(fù)蘇后大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達(dá)。
　　 目的：通過檢測(cè)大鼠心肺復(fù)蘇(CPR)后腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達(dá)的變化來探討硫化氫(H2S)減輕心臟驟停(cardiac arrest)后腦損害的神經(jīng)營養(yǎng)機(jī)制。
　　 方法：雄性SD大鼠160只，初始選擇108只隨機(jī)均分為3組，建立C

16、A/CPR模型。①第一組(36只)：在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后予以NaHS干預(yù)；②第二組(36只)，在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后予以羥胺干預(yù)；③第三組為常規(guī)復(fù)蘇組(36只)。上述三組根據(jù)觀察終點(diǎn)又均分為1天、3天和7天三個(gè)亞組，每個(gè)亞組再等分兩組分別做免疫組化、熒光定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受體酪氨酸蛋白激酶B(T

17、rk B)和P75((P75NTR)。
　　 結(jié)果：①三組經(jīng)歷CPR大鼠死亡及備用鼠使用的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.180，P=0.914)。②在CPR后，三組之間大鼠血清H2S濃度變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.082,P=0.000)。分時(shí)點(diǎn)比較，在CPR后各個(gè)時(shí)點(diǎn)上三組之間血清H2S濃度的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與第三組相比，第一組濃度較高，而第二組濃度較低。③在CPR后，三組之間大鼠大腦皮質(zhì)、海馬組織和