硫化氫對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的探討.pdf

1、目的：以H2O2損傷PC12細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型，探討硫化氫（hydrogen sulfide, H2S）對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并初步探討硫化氫抗神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。 方法：用普通光鏡和Hoechst 33258熒光染色觀察H2O2作用24h后PC12細(xì)胞形態(tài)和核形態(tài)的變化；用四甲基偶氮唑藍(lán)（3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium

2、Bromide,MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況；DNA Ladder抽提試劑盒和碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡；雙氫羅丹明123（Dihydrohodamine 123, DHR123）染色后，鏡下觀察和FCM測(cè)定PC12細(xì)胞的DHR123熒光強(qiáng)度，以明確細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量的變化情況；羅丹明

3、123（Rhodamine 123, Rh123）染色后，鏡下觀察和FCM測(cè)定PC12細(xì)胞的Rh123熒光強(qiáng)度，以了解細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, △Ψm）的變化情況；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果： 1.H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷作用： ①M(fèi)TT結(jié)果顯示，用不同劑量H2O2(50、100、200

4、、400、600μmol/L)作用PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加依次下降。 ②普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞比較，細(xì)胞經(jīng)H2O2( 200、400μmol/L )處理24h后，細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)多為圓形，體積縮小，折光性減弱，貼壁能力降低。 ③細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常PC12細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光；經(jīng)H2O2( 200、400μ

5、mol/L )處理24h后，PC12細(xì)胞有大量的細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞。 ④細(xì)胞經(jīng)PI染色FCM結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞自然凋亡率為3.2％，經(jīng)200和400μmol/LH2O2處理24小時(shí)后，分別可引起28.4％和45.1％的細(xì)胞凋亡（P<0.01）。 2.H2S對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。 2.1 H2S減輕H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活性的抑制作用。 ①M(fèi)TT結(jié)果顯示,4

6、00、800μmol/L NaHS均可明顯降低200、400μmol/L H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的抑制率（P<0.05）。 ②普通光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與H2O2(200μmol/L )損傷組比較，合用NaHS(400μmol/L)處理后，圓形的，體積縮小的，折光性減弱，貼壁能力降低的PC12細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 2.2 H2S對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。 ①DNA Ladder結(jié)果顯示，200μmol/L H

7、2O2作用PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞的DNA被裂解，在瓊脂糖凝膠電泳圖上呈現(xiàn)典型的梯形條帶，合用400μmol/L NaHS處理后能明顯抑制DNA梯帶的形成。 ②Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與H2O2(200μmol/L)損傷組比較，合用NaHS(400μmol/L)處理的PC12細(xì)胞中細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光。 ③FCM結(jié)果顯示

8、，400和800μmol/L NaHS均可明顯抑制200和400μmol/L H2O2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用（P<0.05）。 3.H2S抗PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制。 ①PC12細(xì)胞經(jīng)DHR123染色后, 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，200μmol/L H2O2孵育PC12細(xì)胞3h后，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的DHR123熒光強(qiáng)度較200μmol/LH2O2損傷組明顯減弱；FCM定量分析

9、結(jié)果顯示，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的DHR123平均熒光強(qiáng)度(8.03±2.08)較200μmol/L H2O2損傷組(13.81±2.52)明顯降低(P<0.01)。表明H2S對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成具有抑制作用。 ②PC12細(xì)胞經(jīng)Rh123染色后, 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，200μmol/L H2O2孵育PC12細(xì)胞6h后，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的Rh123熒光強(qiáng)度較

10、200μmol/L H2O2損傷組明顯增強(qiáng)；FCM定量分析結(jié)果顯示，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的Rh123平均熒光強(qiáng)度(16.13±9.5)較200μmol/L H2O2損傷組(10.2±5.57)明顯升高（P<0.01)。表明H2S對(duì)H2O2降低PC12細(xì)胞的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot結(jié)果顯示，200μmol/L H2O2孵育PC12細(xì)胞24h后，與正常對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白的

11、表達(dá)明顯減少，合用400μmol/L NaHS能顯著減輕H2O2對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用。 ④Western Blot結(jié)果顯示，200μmol/L H2O2孵育PC12細(xì)胞24h后，與正常對(duì)照組相比，Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯增加；合用400μmol/L NaHS后，與H2O2損傷組比較，PC12細(xì)胞的Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯降低。 結(jié)論： 1. H2S對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷