硫化氫對PC12細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制的探討.pdf

1、目的：以H2O2損傷PC12細胞為神經(jīng)細胞氧化應激損傷的模型，探討硫化氫（hydrogen sulfide, H2S）對神經(jīng)細胞氧化應激損傷的保護作用，并初步探討硫化氫抗神經(jīng)細胞氧化應激損傷的機制。 方法：用普通光鏡和Hoechst 33258熒光染色觀察H2O2作用24h后PC12細胞形態(tài)和核形態(tài)的變化；用四甲基偶氮唑藍（3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium

2、Bromide,MTT）比色法檢測細胞增殖狀況；DNA Ladder抽提試劑盒和碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式細胞術（flow cytometry, FCM）檢測細胞凋亡；雙氫羅丹明123（Dihydrohodamine 123, DHR123）染色后，鏡下觀察和FCM測定PC12細胞的DHR123熒光強度，以明確細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量的變化情況；羅丹明

3、123（Rhodamine 123, Rh123）染色后，鏡下觀察和FCM測定PC12細胞的Rh123熒光強度，以了解細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, △Ψm）的變化情況；Western Blot檢測細胞Bcl-2和Caspase-3蛋白質的表達。 結果： 1.H2O2對PC12細胞的氧化應激損傷作用： ①MTT結果顯示，用不同劑量H2O2(50、100、200

4、、400、600μmol/L)作用PC12細胞24h后，細胞存活率隨藥物濃度的增加依次下降。 ②普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常細胞比較，細胞經(jīng)H2O2( 200、400μmol/L )處理24h后，細胞數(shù)明顯減少，細胞形態(tài)多為圓形，體積縮小，折光性減弱，貼壁能力降低。 ③細胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常PC12細胞染色質分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光；經(jīng)H2O2( 200、400μ

5、mol/L )處理24h后，PC12細胞有大量的細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞。 ④細胞經(jīng)PI染色FCM結果顯示，PC12細胞自然凋亡率為3.2％，經(jīng)200和400μmol/LH2O2處理24小時后，分別可引起28.4％和45.1％的細胞凋亡（P<0.01）。 2.H2S對H2O2損傷PC12細胞的保護作用。 2.1 H2S減輕H2O2對PC12細胞活性的抑制作用。 ①MTT結果顯示,4

6、00、800μmol/L NaHS均可明顯降低200、400μmol/L H2O2對PC12細胞的抑制率（P<0.05）。 ②普通光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與H2O2(200μmol/L )損傷組比較，合用NaHS(400μmol/L)處理后，圓形的，體積縮小的，折光性減弱，貼壁能力降低的PC12細胞數(shù)量明顯減少。 2.2 H2S對抗H2O2誘導PC12細胞凋亡。 ①DNA Ladder結果顯示，200μmol/L H

7、2O2作用PC12細胞24h后，細胞的DNA被裂解，在瓊脂糖凝膠電泳圖上呈現(xiàn)典型的梯形條帶，合用400μmol/L NaHS處理后能明顯抑制DNA梯帶的形成。 ②Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與H2O2(200μmol/L)損傷組比較，合用NaHS(400μmol/L)處理的PC12細胞中細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細胞數(shù)明顯減少，大部分細胞染色質呈彌漫均勻的低強度熒光。 ③FCM結果顯示

8、，400和800μmol/L NaHS均可明顯抑制200和400μmol/L H2O2對PC12細胞凋亡的誘導作用（P<0.05）。 3.H2S抗PC12細胞氧化應激損傷的作用機制。 ①PC12細胞經(jīng)DHR123染色后, 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，200μmol/L H2O2孵育PC12細胞3h后，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細胞的DHR123熒光強度較200μmol/LH2O2損傷組明顯減弱；FCM定量分析

9、結果顯示，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細胞的DHR123平均熒光強度(8.03±2.08)較200μmol/L H2O2損傷組(13.81±2.52)明顯降低(P<0.01)。表明H2S對H2O2誘導細胞內(nèi)ROS的生成具有抑制作用。 ②PC12細胞經(jīng)Rh123染色后, 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，200μmol/L H2O2孵育PC12細胞6h后，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細胞的Rh123熒光強度較

10、200μmol/L H2O2損傷組明顯增強；FCM定量分析結果顯示，合用400μmol/L NaHS處理的PC12細胞的Rh123平均熒光強度(16.13±9.5)較200μmol/L H2O2損傷組(10.2±5.57)明顯升高（P<0.01)。表明H2S對H2O2降低PC12細胞的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot結果顯示，200μmol/L H2O2孵育PC12細胞24h后，與正常對照組相比，Bcl-2蛋白的

11、表達明顯減少，合用400μmol/L NaHS能顯著減輕H2O2對Bcl-2蛋白表達的抑制作用。 ④Western Blot結果顯示，200μmol/L H2O2孵育PC12細胞24h后，與正常對照組相比，Caspase-3蛋白的表達明顯增加；合用400μmol/L NaHS后，與H2O2損傷組比較，PC12細胞的Caspase-3蛋白的表達明顯降低。 結論： 1. H2S對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激損傷