硫化氫對甲醛損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、【研究背景與目的】
　　甲醛(formaldehyde, FA)是一種具有揮發(fā)性的有毒物質(zhì),其神經(jīng)毒性越來越受到人們的關(guān)注。甲醛暴露可直接造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害。同時(shí),人類機(jī)體自身也可產(chǎn)生甲醛,內(nèi)源性甲醛慢性損傷可能是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。因此,深入探討甲醛神經(jīng)毒性的防治措施具有重要意義。
　　硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)廣泛參與機(jī)體多種生理和病理過程,被認(rèn)為是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第

2、三類氣體信號(hào)分子。近年來,內(nèi)源性 H2S對神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)作用已得到公認(rèn),特別是其抗氧化、神經(jīng)保護(hù)的功能倍受關(guān)注。
　　越來越多的證據(jù)顯示氧化應(yīng)激是甲醛暴露時(shí)產(chǎn)生的最關(guān)鍵效應(yīng)。是否可以用 H2S來防治甲醛的神經(jīng)毒性呢?值得深入研究。為此,本研究將以甲醛損害PC12細(xì)胞為甲醛神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型,探討H2S對甲醛神經(jīng)毒性的拮抗作用及其機(jī)制。
　　【方法】
　　胎盤藍(lán)拒染法觀察PC12細(xì)胞的存活率;Elisa法檢測細(xì)胞上清液中

3、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的含量,評價(jià) PC12細(xì)胞的損傷程度;Hoechst33258染色后,熒光顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞核染色體形態(tài)改變及PI染色流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)檢測細(xì)胞凋亡;羅丹明123(Rhodamine123, Rh123)染色后,FCM檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP);JC-1染色后,

4、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)MMP變化; DCFH-DA染色后,熒光顯微鏡及 FCM檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxydren species, ROS)水平;Western Blot檢測PC12細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和對氧磷酶-1(Paraoxonase-1, PON-1)的蛋白表達(dá)狀況以及細(xì)胞色素 c(cytochrome c, Cyt-c)的釋放;分光光度計(jì)法檢測PC12細(xì)胞內(nèi)PON-1活性。
　　【結(jié)果】
　　1.甲醛對

5、PC12細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制
　　甲醛(60、120、240μmol/L)處理 PC12細(xì)胞24 h后,能濃度依賴性地抑制PC12細(xì)胞的活力、促進(jìn)細(xì)胞LDH的釋放。PC12細(xì)胞經(jīng)120μmol/L甲醛處理24 h后,細(xì)胞變成圓形或橢圓形,而且可見部分細(xì)胞游離于孔壁呈懸浮狀態(tài),并有大量的胞核呈現(xiàn)為強(qiáng)熒光的凋亡細(xì)胞;PI染色FCM定量分析亦表明甲醛(120μmol/L)作用24 h可顯著誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明甲醛對PC12

6、細(xì)胞具有毒性作用。
　　120μmol/L甲醛作用9 h后,細(xì)胞MMP下降;PC12細(xì)胞經(jīng)60、120、240μmol/L甲醛作用24 h后,Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性地降低,Cyt-c的釋放呈濃度依賴性地增強(qiáng),表明甲醛可通過激活細(xì)胞線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性。
　　120μmol/L甲醛處理PC12細(xì)胞9 h后,細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高;甲醛(60、120、240μmol/L)作用24 h后,PC12細(xì)胞PO

7、N-1的蛋白表達(dá)及其酶活性呈濃度依賴性地降低,提示甲醛的神經(jīng)毒性與其抑制PON-1蛋白表達(dá)及其酶活性,進(jìn)而促進(jìn)ROS積累有關(guān)。
　　2.硫化氫對甲醛損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制
　　200μmol/L H2S預(yù)處理30 min可明顯升高120、240μmol/L甲醛作用24 h后的PC12細(xì)胞活力,200、400μmol/L H2S預(yù)處理30 min可明顯升高120μmol/L甲醛作用24 h后的PC12細(xì)胞活力。200

8、μmol/L H2S預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min能顯著降低120μmol/L甲醛處理24 h后對細(xì)胞LDH釋放的促進(jìn)作用、對細(xì)胞形態(tài)的損害作用、對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明H2S對甲醛損傷PC12細(xì)胞具有拮抗作用。
　　200μmol/L H2S預(yù)處理30 min可顯著抑制120μmol/L甲醛對PC12細(xì)胞MMP的降低作用、對Bcl-2表達(dá)的下調(diào)作用和對Cyt-c釋放的促進(jìn)作用,表明H2S可阻止甲醛激活細(xì)胞線粒體凋亡通路

9、。
　　200μmol/L H2S預(yù)處理30 min可顯著減輕120μmol/L甲醛對PC12細(xì)胞內(nèi)ROS積累的誘導(dǎo)作用、對細(xì)胞PON-1表達(dá)及其活性的抑制作用,而且200μmol/L H2S可顯著增強(qiáng)PON-1的活性,表明H2S可抑制ROS積累,阻止甲醛抑制PON-1的表達(dá)和活性,并能上調(diào)PON-1的活性。
　　200μmol/L PON-1的特異性抑制劑二羥基喹啉(2-Hydroxy-4-methylquinoline,

10、2-HQ)預(yù)處理30 min可顯著降低200μmol/L H2S對甲醛(120μmol/L,24h)促進(jìn)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS積累、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低PC12細(xì)胞活力的拮抗作用,表明H2S可通過阻止甲醛抑制PON-1的表達(dá)和活性、增強(qiáng)PON-1的活性而降低細(xì)胞ROS的積累,進(jìn)而阻止甲醛激活細(xì)胞線粒體凋亡通路而實(shí)現(xiàn)其抗甲醛神經(jīng)毒性作用。
　　【結(jié)論】
　　1.甲醛對PC12細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,其機(jī)理可能與其抑制細(xì)胞PON-1蛋