EGCG對PQ誘導的PC12細胞凋亡的保護作用及其機制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease, PD)是以黑質致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神經元進行性變性減少為特征的神經系統(tǒng)疾病。雖然PD 的病因仍不明確，但已發(fā)現(xiàn)一些與其發(fā)病相關的危險因素，如遺傳，年齡及環(huán)境。 由于農村居住、飲用井水或職業(yè)原因而長期接觸農藥被認為是一種可能的環(huán)境因素。 百草枯(paraquat, PQ)，一種廣泛使用的除草劑，由于其與1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-

2、methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)活性代謝產物MPP+(1-methyl-4-phenyl pyridinium cation)結構的相似性，日益引起人們的濃厚興趣。MPTP 是一種人工合成的神經毒性物質，能使動物和人出現(xiàn)PD 癥狀。因此，PQ 與MPP+結構的相似性提示我們PQ 可能是PD 發(fā)病的環(huán)境因素之一。流行病學研究顯示農業(yè)中PQ 的使用與PD的發(fā)病率具有相關性。而

3、且，已有資料報道PQ 可選擇性損傷DA 能神經元并導致動物神經行為學癥狀的出現(xiàn)。 綠茶，由于其對癌癥、心血管疾病、炎性疾病及神經退行性疾病等多種疾病的有益作用而越來越受到人們的喜愛。近年來，綠茶的神經保護作用逐漸成為人們關注的焦點。研究顯示長期堅持每天飲用兩杯或兩杯以上的綠茶與PD 患病率的下降有關。在PD 的細胞模型中也證實了綠茶提取物的神經保護作用。 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(?)-epigallocatechin

4、-3-gallate, EGCG），綠茶多酚的主要成分，綠茶提取物的生物活性主要是由EGCG 來發(fā)揮的。 已有實驗證實EGCG 可以減輕由神經毒性物質、缺血、缺氧及血清撤除等因素造成的神經細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，EGCG 可抑制MPTP 誘導的DA 能神經元變性。繼之其后，有報道認為抑制黑質中神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的產生是EGCG對MPTP 毒性阻

5、斷作用的可能機制之一。然而，EGCG 對PQ 誘導的DA能神經元的損傷是否具有保護作用，目前尚未見報道。本研究選擇具有DA 能神經元特性的PC12 細胞建立體外模型，旨在觀察EGCG 對PQ 誘導的DA 能神經元損傷是否具有保護作用，并從細胞凋亡角度對EGCG的作用機制做初步探討。實驗內容如下： 實驗一 目的：篩選出PQ 誘導PC12 細胞損傷的有效濃度、時間及EGCG 對該濃度PQ 損傷PC12 細胞的有效保護濃度。

6、 方法：PQ 損傷作用：設空白對照組及200、400、600、800、1000 μmol/L 五個PQ 濃度組，各濃度設12、24、36、48h 四個干預時間。EGCG 保護作用：設空白對照組、PQ 損傷組(800 μmol/L)、不同濃度的EGCG(1、5、10、50、100、200 μmol/L)保護組，采用MTT 比色法對各濃度進行篩選。 結果：經MTT 比色法檢測，PQ 對PC12 細胞具有損傷作用，其誘導的細胞活

7、力的降低具有劑量和時間依賴性。與對照組相比，800 μmol/L PQ 處理24h 后細胞活力為53±3.2％ (P<0.001)。而PC12 細胞經不同濃度的EGCG 預處理2h 后，再經800 μmol/L 的PQ 處理24h，我們發(fā)現(xiàn)1、5、10 μmol/L EGCG 預處理組與PQ 組(54.6±3.5％)相比，可減少細胞死亡，細胞活力分別上升為66.5±2.7％ (P>0.05)、74.4±2.6％ (P<0.05)、83.

8、7±3.2％ (P<0.01)，但高濃度的EGCG (50、100、200 μmol/L)則沒有保護作用。 結論：PQ 對PC12細胞具有損傷作用，且其損傷作用具有劑量和時間依賴性；EGCG 的生物活性具有濃度依賴性的雙相調節(jié)模式：低濃度的EGCG 對PQ 所誘導的PC12 細胞損傷具有保護作用，而高濃度的EGCG 則沒有保護作用。 實驗二 目的：探討EGCG 對PQ 誘導PC12 細胞凋亡的保護作用。

9、方法：MTT 比色試驗檢測細胞活性；Hoechst 染色觀察細胞核形態(tài)的改變；TUNEL 染色觀察細胞DNA 的斷裂情況；FCM 檢測細胞凋亡比例。 結果：MTT 法檢測顯示，1、5、10 μmol/L EGCG 可抑制800 μmol/L PQ 作用24h所誘導的PC12 細胞活性的降低，與PQ 組(54.6±3.5％)相比，EGCG 預處理后細胞活力分別上升為66.5±2.7％ (P>0.05)、74.4±2.6％ (P<0

10、.05)、83.7±3.2％ (P<0.01)；正常細胞核經Hoechst 染色后顯示為較大的圓形，形態(tài)規(guī)則，染色均勻彌散。經PQ 處理24h 后，多數(shù)細胞顯示胞核凝集，呈現(xiàn)不均勻的亮藍色熒光。與PQ 組相比(43.5±8.4％)，1、5、10 μmol/L EGCG預處理可減少胞核凝集，分別下降至30.7±7.9％ (P<0.05)、17.9±6.8％(P<0.001)、11.2±4.4％ (P<0.001)；TUNEL 染色顯示，P

11、Q 組(32.4±6.7％)與對照組(5.2±1.9％)相比，TUNEL 陽性細胞增加(P<0.001)。而經EGCG預處理后，與PQ 組相比，TUNEL 陽性細胞的數(shù)量明顯減少至25.9±7.7％(P>0.05)、16.6±3.2％ (P<0.01)、9.6±3.2％ (P<0.001)；FCM 結果顯示，PQ處理后，凋亡細胞的比例(39.9％)與對照組(4％)相比是增加的，而經1、5、10 μmol/L EGCG 預處理后，凋亡細胞

12、比例分別降至32.6％，20.1％，10.4％。 結論：EGCG 可抑制PQ 誘導的PC12 細胞凋亡。 實驗三 目的：探討EGCG 對PQ 誘導PC12 細胞凋亡保護作用的相關機制。 方法：Rhodamine123 染色檢測MMP；Caspase-3 活性檢測；免疫細胞化學染色及Western blotting 方法檢測凋亡相關蛋白(Cyto C、Smac)表達。 結果：Rhodamine123

13、 染色顯示，800 μmol/L PQ 處理24h 后，細胞的熒光強度與對照相比顯著降低(P<0.001)。而EGCG 可劑量依賴性的減輕MMP的下降。與PQ 組(26.2±2.8％)相比，經1、5、10 μmol/L EGCG 預處理后，細胞熒光強度分別增至41.3±3.6％(P<0.01) ， 56.7±5.4％(P<0.001) ，82.9±4.2％(P<0.001)；PQ 組與正常對照組相比，Caspase-3 活性顯著增強(P

14、<0.001)，而這種激活可被1、5、10 μmol/L EGCG 預處理所抑制。與PQ 組(216.5±9.6)相比，經EGCG 預處理后，Caspase-3 活性分別降至179.9±7.6(P<0.001)、123.2±8.1 (P<0.001)、68.5±6.1(P<0.001)；免疫細胞化學染色顯示正常組細胞形態(tài)良好，Cyto C、Smac 染色呈淡棕黃色，均勻分布于胞質及突起內。PQ 處理后部分細胞變圓，皺縮，Cyto C、S

15、mac在細胞內表達增強，染色呈深棕黃色。相對于PQ 組，EGCG 預處理組的Cyto C、Smac 免疫細胞化學染色明顯減弱，細胞形態(tài)也有改善。Westernblotting 檢測Smac 蛋白表達結果表明PQ 處理后胞漿內Smac 表達增加，EGCG 預處理可以抑制這種改變。 結論：EGCG 對PQ 誘導的PC12 細胞凋亡具有保護作用，機制可能與其維持細胞MMP、抑制Caspase-3 激活、調節(jié)凋亡相關蛋白Cyto C 及