EGCG對(duì)PQ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease, PD)是以黑質(zhì)致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性減少為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。雖然PD 的病因仍不明確，但已發(fā)現(xiàn)一些與其發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素，如遺傳，年齡及環(huán)境。 由于農(nóng)村居住、飲用井水或職業(yè)原因而長(zhǎng)期接觸農(nóng)藥被認(rèn)為是一種可能的環(huán)境因素。 百草枯(paraquat, PQ)，一種廣泛使用的除草劑，由于其與1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-

2、methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)活性代謝產(chǎn)物MPP+(1-methyl-4-phenyl pyridinium cation)結(jié)構(gòu)的相似性，日益引起人們的濃厚興趣。MPTP 是一種人工合成的神經(jīng)毒性物質(zhì)，能使動(dòng)物和人出現(xiàn)PD 癥狀。因此，PQ 與MPP+結(jié)構(gòu)的相似性提示我們PQ 可能是PD 發(fā)病的環(huán)境因素之一。流行病學(xué)研究顯示農(nóng)業(yè)中PQ 的使用與PD的發(fā)病率具有相關(guān)性。而

3、且，已有資料報(bào)道PQ 可選擇性損傷DA 能神經(jīng)元并導(dǎo)致動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)癥狀的出現(xiàn)。 綠茶，由于其對(duì)癌癥、心血管疾病、炎性疾病及神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的有益作用而越來(lái)越受到人們的喜愛(ài)。近年來(lái)，綠茶的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究顯示長(zhǎng)期堅(jiān)持每天飲用兩杯或兩杯以上的綠茶與PD 患病率的下降有關(guān)。在PD 的細(xì)胞模型中也證實(shí)了綠茶提取物的神經(jīng)保護(hù)作用。 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(?)-epigallocatechin

4、-3-gallate, EGCG），綠茶多酚的主要成分，綠茶提取物的生物活性主要是由EGCG 來(lái)發(fā)揮的。 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGCG 可以減輕由神經(jīng)毒性物質(zhì)、缺血、缺氧及血清撤除等因素造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，EGCG 可抑制MPTP 誘導(dǎo)的DA 能神經(jīng)元變性。繼之其后，有報(bào)道認(rèn)為抑制黑質(zhì)中神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的產(chǎn)生是EGCG對(duì)MPTP 毒性阻

5、斷作用的可能機(jī)制之一。然而，EGCG 對(duì)PQ 誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元的損傷是否具有保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇具有DA 能神經(jīng)元特性的PC12 細(xì)胞建立體外模型，旨在觀察EGCG 對(duì)PQ 誘導(dǎo)的DA 能神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用，并從細(xì)胞凋亡角度對(duì)EGCG的作用機(jī)制做初步探討。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 實(shí)驗(yàn)一 目的：篩選出PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的有效濃度、時(shí)間及EGCG 對(duì)該濃度PQ 損傷PC12 細(xì)胞的有效保護(hù)濃度。

6、 方法：PQ 損傷作用：設(shè)空白對(duì)照組及200、400、600、800、1000 μmol/L 五個(gè)PQ 濃度組，各濃度設(shè)12、24、36、48h 四個(gè)干預(yù)時(shí)間。EGCG 保護(hù)作用：設(shè)空白對(duì)照組、PQ 損傷組(800 μmol/L)、不同濃度的EGCG(1、5、10、50、100、200 μmol/L)保護(hù)組，采用MTT 比色法對(duì)各濃度進(jìn)行篩選。 結(jié)果：經(jīng)MTT 比色法檢測(cè)，PQ 對(duì)PC12 細(xì)胞具有損傷作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞活

7、力的降低具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，800 μmol/L PQ 處理24h 后細(xì)胞活力為53±3.2％ (P<0.001)。而PC12 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGCG 預(yù)處理2h 后，再經(jīng)800 μmol/L 的PQ 處理24h，我們發(fā)現(xiàn)1、5、10 μmol/L EGCG 預(yù)處理組與PQ 組(54.6±3.5％)相比，可減少細(xì)胞死亡，細(xì)胞活力分別上升為66.5±2.7％ (P>0.05)、74.4±2.6％ (P<0.05)、83.

8、7±3.2％ (P<0.01)，但高濃度的EGCG (50、100、200 μmol/L)則沒(méi)有保護(hù)作用。 結(jié)論：PQ 對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，且其損傷作用具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性；EGCG 的生物活性具有濃度依賴(lài)性的雙相調(diào)節(jié)模式：低濃度的EGCG 對(duì)PQ 所誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，而高濃度的EGCG 則沒(méi)有保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)二 目的：探討EGCG 對(duì)PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

9、方法：MTT 比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性；Hoechst 染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變；TUNEL 染色觀察細(xì)胞DNA 的斷裂情況；FCM 檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。 結(jié)果：MTT 法檢測(cè)顯示，1、5、10 μmol/L EGCG 可抑制800 μmol/L PQ 作用24h所誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活性的降低，與PQ 組(54.6±3.5％)相比，EGCG 預(yù)處理后細(xì)胞活力分別上升為66.5±2.7％ (P>0.05)、74.4±2.6％ (P<0

10、.05)、83.7±3.2％ (P<0.01)；正常細(xì)胞核經(jīng)Hoechst 染色后顯示為較大的圓形，形態(tài)規(guī)則，染色均勻彌散。經(jīng)PQ 處理24h 后，多數(shù)細(xì)胞顯示胞核凝集，呈現(xiàn)不均勻的亮藍(lán)色熒光。與PQ 組相比(43.5±8.4％)，1、5、10 μmol/L EGCG預(yù)處理可減少胞核凝集，分別下降至30.7±7.9％ (P<0.05)、17.9±6.8％(P<0.001)、11.2±4.4％ (P<0.001)；TUNEL 染色顯示，P

11、Q 組(32.4±6.7％)與對(duì)照組(5.2±1.9％)相比，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞增加(P<0.001)。而經(jīng)EGCG預(yù)處理后，與PQ 組相比，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少至25.9±7.7％(P>0.05)、16.6±3.2％ (P<0.01)、9.6±3.2％ (P<0.001)；FCM 結(jié)果顯示，PQ處理后，凋亡細(xì)胞的比例(39.9％)與對(duì)照組(4％)相比是增加的，而經(jīng)1、5、10 μmol/L EGCG 預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞

12、比例分別降至32.6％，20.1％，10.4％。 結(jié)論：EGCG 可抑制PQ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)三 目的：探討EGCG 對(duì)PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。 方法：Rhodamine123 染色檢測(cè)MMP；Caspase-3 活性檢測(cè)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blotting 方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(Cyto C、Smac)表達(dá)。 結(jié)果：Rhodamine123

13、 染色顯示，800 μmol/L PQ 處理24h 后，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比顯著降低(P<0.001)。而EGCG 可劑量依賴(lài)性的減輕MMP的下降。與PQ 組(26.2±2.8％)相比，經(jīng)1、5、10 μmol/L EGCG 預(yù)處理后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別增至41.3±3.6％(P<0.01) ， 56.7±5.4％(P<0.001) ，82.9±4.2％(P<0.001)；PQ 組與正常對(duì)照組相比，Caspase-3 活性顯著增強(qiáng)(P

14、<0.001)，而這種激活可被1、5、10 μmol/L EGCG 預(yù)處理所抑制。與PQ 組(216.5±9.6)相比，經(jīng)EGCG 預(yù)處理后，Caspase-3 活性分別降至179.9±7.6(P<0.001)、123.2±8.1 (P<0.001)、68.5±6.1(P<0.001)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示正常組細(xì)胞形態(tài)良好，Cyto C、Smac 染色呈淡棕黃色，均勻分布于胞質(zhì)及突起內(nèi)。PQ 處理后部分細(xì)胞變圓，皺縮，Cyto C、S

15、mac在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，染色呈深棕黃色。相對(duì)于PQ 組，EGCG 預(yù)處理組的Cyto C、Smac 免疫細(xì)胞化學(xué)染色明顯減弱，細(xì)胞形態(tài)也有改善。Westernblotting 檢測(cè)Smac 蛋白表達(dá)結(jié)果表明PQ 處理后胞漿內(nèi)Smac 表達(dá)增加，EGCG 預(yù)處理可以抑制這種改變。 結(jié)論：EGCG 對(duì)PQ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其維持細(xì)胞MMP、抑制Caspase-3 激活、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Cyto C 及