2,5-己二酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及其機(jī)制探討.pdf

1、研究背景:正己烷作為一種有機(jī)溶劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)粘膠、印刷、電子微電子等行業(yè)。職業(yè)暴露過程中如果防護(hù)不當(dāng)，正己烷將經(jīng)呼吸道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體導(dǎo)致中毒。長(zhǎng)期接觸正己烷可導(dǎo)致以多發(fā)性周圍神經(jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒，臨床上主要表現(xiàn)為四肢麻木、行走無力，肌肉萎縮等。2，5-己二酮（2，5-HD）是正己烷在體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物，也是正己烷誘發(fā)神經(jīng)毒性的終毒物。
　　2，5-HD神經(jīng)毒性作用的發(fā)生機(jī)制尚不明確。許多研究顯示，2，5-HD可

2、導(dǎo)致神經(jīng)元胞體和軸突損傷、神經(jīng)元數(shù)量減少。研究發(fā)現(xiàn)，Bax、Bcl-2和Caspase-3參與多種因素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，Bax和Bcl-2是最重要的凋亡調(diào)控基因，Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。那么，2，5-HD誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性是否與凋亡有關(guān)，Bax、Bcl-2和Caspase-3是否參與了2，5-HD的神經(jīng)毒性機(jī)制？這些問題引起了我們的關(guān)注。
　　目的:探討2，5-HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制，為闡明2，5-H

3、D的神經(jīng)毒作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法:以PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元的細(xì)胞模型，0、10mM、20mM和40mM2，5-HD分別染毒12h、24h、36h。用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率;用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞核的變化;透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12的細(xì)胞凋亡率;用Real-timePCR檢測(cè)Bax、B

4、cl-2和Caspase-3基因的表達(dá)情況;用Westernblot檢測(cè)Bax與Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨2，5-HD濃度增加和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降。蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察到2，5-HD染毒后PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。Hoechst33342熒光染色觀察到特征性凋亡細(xì)胞核。透射電子顯微鏡觀察可見，40mM的2，5-HD作用36h后，核仁消失，染色質(zhì)聚集移動(dòng)，有特征性凋亡小體形成

5、。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)到細(xì)胞凋亡率隨2，5-HD劑量增高而上升，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。RealTimePCR結(jié)果顯示隨2，5-HD劑量的增加和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，Bax和Caspase-3mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2mRNA表達(dá)水平下調(diào)。Westernblot顯示，隨2，5-HD濃度增加和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論:2，5-HD暴露可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，上調(diào)