2,5-己二酮致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Sonichedgehog信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、正已烷(n-hexane，CAS：110-54-3)，別名己烷，屬于直鏈飽和脂肪烴類，2,5-己二酮(2,5-hexanedione，2,5-HD)是正己烷體內(nèi)代謝的主要活性產(chǎn)物，與正己烷的毒性有關(guān)。正己烷作為有機(jī)溶劑被廣泛應(yīng)用的同時(shí)，如職業(yè)接觸防護(hù)不當(dāng)，特別是女工職業(yè)接觸機(jī)會(huì)較多，會(huì)導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)與功能的損傷。國(guó)內(nèi)外對(duì)正己烷和2,5-HD毒性作用進(jìn)行了較為廣泛地研究，但主要集中在神經(jīng)毒性方面，對(duì)生殖系統(tǒng)的毒理?yè)p傷，尤其是對(duì)女性生殖功能的

2、影響報(bào)道較少，其毒性作用機(jī)制還有待進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。2005年，有學(xué)者首次報(bào)道了來(lái)源于小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)通路，隨后研究較多的是Sonic hedgehog(SHH)。SHH信號(hào)通路對(duì)許多組織細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控以及在生殖腺(睪丸、卵巢)、子宮和附屬性腺(前列腺、乳腺)等生殖系統(tǒng)中的研究是近幾年的熱點(diǎn)。因此，本研究采用體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過(guò)建立和優(yōu)化體外分離和培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)體系，研究2,5-H

3、D致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制及SHH信號(hào)通路在該過(guò)程中的調(diào)控作用，可以為明確2,5-HD對(duì)女性生殖功能的毒性損傷、作用機(jī)理以及涉及該通路的調(diào)控機(jī)制提供重要的參考依據(jù)，以期為進(jìn)一步開(kāi)展緩解或阻斷2,5-HD致卵巢毒性損傷的研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過(guò)建立高效、穩(wěn)定的體外分離、培養(yǎng)、鑒定人卵巢顆粒細(xì)胞的研究體系，從人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化及與細(xì)胞凋亡有關(guān)的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE

4、家族(CASPASE-3)的表達(dá)變化，探討2,5-HD致卵巢毒性的作用機(jī)制。同時(shí)，研究Sonic hedgehog信號(hào)通路在2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用方式及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究如何緩解或阻斷2,5-HD致卵巢毒性損傷提供新思路。
　　方法：
　　1.分離行輔助生殖助孕技術(shù)治療的、符合研究納入標(biāo)準(zhǔn)的、不孕患者的卵巢顆粒細(xì)胞，采用梯度離心、紅細(xì)胞裂解液裂解及胰蛋白酶消化等方法，分離人卵巢顆粒細(xì)胞。同時(shí)，采用

5、蘇木素-伊紅(HE)染色、促卵泡生成素受體(FSHR)免疫組化染色對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌功能進(jìn)行測(cè)定。
　　2.以體外培養(yǎng)48h的人卵巢顆粒細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用2,5-HD終濃度為0、16μmol/L、64μmol/L和256μmol/L的DMEM培養(yǎng)液體外染毒24h，通過(guò)采用HE染色、Hoechst33342熒光染色、CASPASE-3 p17免疫組化

6、染色、透射電鏡以及流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)2,5-HD誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的改變。再進(jìn)一步采用realtime PCR和Western blot法，分別檢測(cè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE家族(CASPASE-3)的mRNA、蛋白水平隨著2,5-HD染毒濃度的增加其表達(dá)量的變化情況。
　　3.選擇研究致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡效應(yīng)最顯著的256μmol/L2,5-HD體

7、外染毒24h過(guò)程的顆粒細(xì)胞和正常對(duì)照組顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，采用realtime PCR，測(cè)定內(nèi)源性SHH信號(hào)通路在2,5-HD作用24h致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的mRNA的表達(dá)改變；采用Western blot法，測(cè)定內(nèi)源性SHH信號(hào)通路主要效應(yīng)分子SHH、GLI1在2,5-HD作用24h致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的蛋白表達(dá)改變情況。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定外源性重組SHH因子和SHH信號(hào)通路阻滯劑Cyclopamine對(duì)SHH信號(hào)通路的激活或

8、阻斷，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證SHH信號(hào)通路對(duì)2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的影響，以及對(duì)抗凋亡基因BCL-2和凋亡基因BAX mRNA、蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.人卵巢顆粒細(xì)胞分離、原代培養(yǎng)與鑒定體系的建立：(1)臺(tái)盼藍(lán)染色顯示實(shí)驗(yàn)分離的人卵巢顆粒細(xì)胞存活率>90％，細(xì)胞表達(dá)FSHR的陽(yáng)性率>95%。(2)光鏡下觀察到，人卵巢顆粒細(xì)胞體外生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)2d后細(xì)胞明顯增殖，細(xì)胞與細(xì)胞之間有絲狀突起相連；第6-7d時(shí)細(xì)胞逐

9、漸變形、退化。(3)采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖曲線顯示，人卵巢顆粒細(xì)胞隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增殖,培養(yǎng)24h時(shí)細(xì)胞處于貼壁生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)第3-5d時(shí)達(dá)到分裂高峰，隨后第6-7d細(xì)胞開(kāi)始逐漸退化。(4)體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細(xì)胞在重組人促卵泡激素(rFSH)作用下可明顯促進(jìn)E2的分泌，但分泌孕酮(P)的能力與rFSH的作用無(wú)關(guān)，體外分離、原代培養(yǎng)的人卵巢顆粒細(xì)胞保持了原有細(xì)胞的功能特性。
　　2.2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)

10、制的研究：本研究建立了2,5-HD誘導(dǎo)的人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡模型，由相差顯微鏡、光鏡、熒光顯微鏡和透射電鏡可觀察到特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變，且隨著2,5-HD染毒濃度的增加出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變的人卵巢顆粒細(xì)胞會(huì)逐漸增多。流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，2,5-HD終濃度為64μmol/L、256μmol/L時(shí)可顯著增加顆粒細(xì)胞的凋亡率。realtime PCR結(jié)果顯示，隨著2,5-HD染毒濃度的增加，BCL-2 m

11、RNA水平呈下降趨勢(shì)，BAX、CASPASE-3 mRNA水平呈上升趨勢(shì)。Western blot與realtime PCR結(jié)果相一致，表現(xiàn)為隨著2,5-HD染毒濃度的增加，BCL-2蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，凋亡蛋白BAX、凋亡下游執(zhí)行蛋白CASPASE-3(p17)表達(dá)呈上升趨勢(shì)。
　　3.Sonic hedgehog信號(hào)通路在2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的調(diào)控作用：(1)對(duì)照組人卵巢顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，有少量SHH

12、信號(hào)通路組分表達(dá)，但隨時(shí)間改變無(wú)明顯改變；在2,5-HD作用24h過(guò)程中，顆粒細(xì)胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1 mRNA水平在3h、6h時(shí)分別與對(duì)照組比較差異顯著；SHH、SMO和GLI1mRNA水平在24h時(shí)均有下降；GLI2和GLI3 mRNA水平與對(duì)照組比較在不同時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；人卵巢顆粒細(xì)胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1mRNA水平在3h、6h時(shí)升高分別為對(duì)照組的2-5倍、5-8倍，隨后于24h時(shí)降到低

13、值。(2)與realtime PCR結(jié)果相一致，對(duì)照組人卵巢顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中， SHH信號(hào)通路主要效應(yīng)分子SHH、GLI1蛋白有少量表達(dá)，隨時(shí)間改變無(wú)明顯差異；在2,5-HD作用24h過(guò)程中，顆粒細(xì)胞SHH和GLI1蛋白水平在3h、6h時(shí)升高分別與對(duì)照組比較差異顯著，在24h時(shí)均有下降。(3)外源性SHH因子可增加人卵巢顆粒細(xì)胞的存活率，減少2,5-HD作用導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；用外源性Cyclopamine阻滯SHH信號(hào)通路會(huì)增加人

14、卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率。(4)在2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中采用外源性重組SHH因子處理會(huì)導(dǎo)致抗凋亡基因BCL-2表達(dá)上調(diào)，凋亡基因BAX表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1.采用本研究所建立的方法可獲得生長(zhǎng)活性較好、細(xì)胞純度高及穩(wěn)定的人卵巢顆粒細(xì)胞，用HE染色和FSHR免疫組化染色法可簡(jiǎn)便快速地鑒定人卵巢顆粒細(xì)胞。
　　2.2,5-HD通過(guò)誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞BCL-2家族中凋亡基因(BAX)表達(dá)上升和抗凋亡基因(B

15、CL-2)表達(dá)下降，引起凋亡下游執(zhí)行蛋白 CASPASE-3(p17)表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡增加，有可能是其致卵巢功能受損的機(jī)制之一，明確BCL-2家族對(duì)2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，可以為女性生殖毒性損傷的臨床診斷、確定分子治療靶點(diǎn)的研究提供參考依據(jù)。
　　3.體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細(xì)胞有少量SHH信號(hào)通路組分表達(dá)。在2,5-HD致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中SHH信號(hào)通路會(huì)被激活，起到了降低顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)