γ-氨基丁酸對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮分泌及凋亡的影響.pdf

1、γ-氨基丁酸（γ-gamma-aminobutyric acid，GABA）由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧而成，是中樞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。近年來人們發(fā)現(xiàn)30多種外周組織中有GABA存在，特別是卵巢和輸卵管中含量最高，提示GABA可能對(duì)生殖系統(tǒng)有某種生理作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢中有GABA能神經(jīng)元，卵巢組織上有GABA的特異性結(jié)合位點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示外源性GABA對(duì)黃素化顆粒細(xì)胞分泌雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Proge

2、sterone，P）有抑制作用，并且這種抑制作用可能與GABA受體及腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)有關(guān)。有資料表明GABA可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠黃體顆粒細(xì)胞自發(fā)凋亡。國內(nèi)外許多學(xué)者報(bào)道IVF-ET中顆粒細(xì)胞凋亡增加影響妊娠的結(jié)局。本實(shí)驗(yàn)利用電化學(xué)發(fā)光法探索外源性GABA影響人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌雌二醇及孕酮的可能機(jī)制，并且通過TUNNEL法檢測(cè)外源性GABA對(duì)人黃素化顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并利用ELISA法測(cè)定GABA濃度，探索外源性GABA對(duì)IVF-

3、ET妊娠結(jié)局的影響。 第一部分 GABA對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮分泌的影響 文獻(xiàn)已證實(shí)外源性GABA對(duì)大鼠卵巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2和P有抑制作用，并且可能與GABA受體及腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)有關(guān)。但外源性GABA是否對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2和P也有抑制作用，尚未有人做過這樣的報(bào)道。 [研究目的] 本實(shí)驗(yàn)采用電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence ECL）探索外源性GABA對(duì)

4、人卵巢巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2和P的可能作用機(jī)制。 [材料和方法] 1.標(biāo)本來源來自2008.12-2009.1于南方醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI-ET的患者32例，且為首個(gè)IVF/ICSI-ET治療周期，年齡均小于35歲，不孕原因均為輸卵管因素不孕或男性因素不孕，均采用長周期降調(diào)節(jié)方案。在取卵日獲取患者卵泡液，離心分離黃素化顆粒細(xì)胞，將分離出的黃素化顆粒細(xì)胞分為4組進(jìn)行體外培養(yǎng)24小時(shí)，換液，換為無血清培養(yǎng)基，加入處

5、理因子，使培養(yǎng)液的終體積為1ml，GABA濃度為4×10-6mol/L，GABA阻斷劑荷包牡丹堿（Bicuculine）濃度為1×10-6mol/L，腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑（Forskolin）濃度為1x10-3 mol/L，人絨毛膜促性腺激素（hCG）濃度為0.1IU/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)留取上清液液待測(cè)。 2.分組; （1）加入GABA（4×10-6mol/L），觀察GABA對(duì)人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞雌二醇及孕酮分泌的影響

6、（n=8），分為2組：對(duì)照組；GABA組。 （2）加入GABA阻斷劑荷包牡丹堿（Bicuculine，1×10-6mol/L），觀察GABA對(duì)Bicuculine誘導(dǎo)的人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞雌二醇及孕酮分泌的影響（n=8），分為4組：對(duì)照組；GABA組；Bicuculine；GABA+Bicuculine。 （3）.加入腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑（Forskolin，1×10-3mol/L），觀察GABA對(duì)Forskolin誘導(dǎo)的

7、人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞雌二醇及孕酮分泌的影響（n=8），分為4組：對(duì)照組；GABA組；Forskol in：GABA+Forskolin。 （4）加入人絨毛膜促性腺激素（hCG，0.1IU/ml），觀察GABA對(duì)hCG誘導(dǎo)的人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞雌二醇及孕酮分泌的影響（n=8），分為4組：對(duì)照組；GABA組：hCG；GABA+hCG。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法人雌二醇和孕酮測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測(cè)上清液中E2和P濃度，比較各組中

8、激素濃度的變化。利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組與GABA組之間激素水平的差異；采用析因方差分析比較各處理組與對(duì)照組之間激素水平的差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.加入4×10-6mol/L的GABA抑制人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌； 2.1×10-6mol/L的GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿（Bicuculine）能促進(jìn)人卵巢

9、黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制Bicuculine誘導(dǎo)的人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌； 3.1×10-3mol/L的腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑（Forskolin）能促進(jìn)人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制Forskolin誘導(dǎo)的人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌； 4.0.1IU/ml的人絨毛膜促性腺激素（hCG）能促進(jìn)人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制hCG誘導(dǎo)的

10、人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌。 [小結(jié)] 本實(shí)驗(yàn)提示： 1.加入4×10-6mol/L的GABA抑制人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌； 2.GABA影響人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌可能通過顆粒細(xì)胞膜上的GABA受體介導(dǎo)； 3.GABA影響人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌與腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)有關(guān)； 4.GABA和HCG相應(yīng)受體相互作用時(shí)可能相互影響。 第二部分 GABA

11、對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響。 許多研究報(bào)道卵巢中體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的凋亡均與卵泡閉鎖有關(guān)，而對(duì)卵巢體細(xì)胞凋亡的研究又主要集中于顆粒細(xì)胞。 [研究目的] 本實(shí)驗(yàn)研究在IVF周期中，妊娠組與非妊娠組卵泡液中GABA的濃度及外源性GABA對(duì)人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞凋亡的影響。 [材料和方法] 1.標(biāo)本來源來自2008.12-2009.1于南方醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI-ET的患者40例，且為首個(gè)IVF/ICSI

12、-ET治療周期，年齡均小于35歲，不孕原因均為輸卵管因素不孕或男性因素不孕，均采用長周期降調(diào)節(jié)方案。①顆粒細(xì)胞的收集：在取卵日獲取患者的卵泡液，離心分離黃素化顆粒細(xì)胞，將分離出的黃素化顆粒細(xì)胞分為2組進(jìn)行體外培養(yǎng)24小時(shí)，換液，換為無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組即GABA組加入GABA，使培養(yǎng)液的終體積為1ml，GABA濃度為4×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，去掉上清液，收集貼壁細(xì)胞涂片。②卵泡液的收集：取卵日留取成熟卵泡（≥15mm）的

13、穿刺液，離心，取上清裝入EP管待測(cè)卵泡液中的GABA濃度。 2.分組; 1）分為妊娠組（17例）和非妊娠組（23例）分別測(cè)定兩組病人成熟卵泡液中的GABA濃度，比較差異。 2）分為對(duì)照組和GABA組，比較凋亡率。（n=10） 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用人γ-氨基丁酸ELISA試劑盒檢測(cè)卵泡液中GABA濃度，比較兩組卵泡液中GABA濃度，TUNNEL法測(cè)凋亡率，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比

14、較兩組濃度的差異及兩組凋亡率的差異，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.妊娠組GABA的濃度明顯低于非妊娠組的濃度（680.398±11.279 vs713.832±9.517）ng/ml，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2.對(duì)照組和GABA組人黃體化顆粒細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)分別為（20.08±2.44 vs29.27±2.02）％，GABA組凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

15、 [小結(jié)] 1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定出人卵泡液中GABA的濃度在非妊娠組組高于妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.本實(shí)驗(yàn)在人卵巢體外培養(yǎng)的黃體化顆粒細(xì)胞中加入GABA，發(fā)現(xiàn)GABA可使培養(yǎng)的黃體化顆粒細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 全文小結(jié) 1.本實(shí)驗(yàn)采用電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測(cè)E2和P濃度，觀察γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)人黃體化顆粒細(xì)胞E2和P分泌的影響，并且探討GABA影響人黃體化顆粒細(xì)胞E2和P分泌的

16、可能作用機(jī)制。結(jié)果提示：①加入4×10-5mol/L的GABA抑制人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌；②GABA影響人卵巢黃體化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌可能通過顆粒細(xì)胞膜上的GABA受體介導(dǎo)；與腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)有關(guān)；GABA和HCG相應(yīng)受體相互作用時(shí)可能相互影響。 2.運(yùn)用免疫熒光法（ELISA）研究在IVF周期中妊娠組與非妊娠組顆粒細(xì)胞中GABA的濃度，結(jié)果表明非妊娠組的GABA濃度顯著高于妊娠組；并且通過脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移