米非司酮對體外大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本實驗通過研究不同劑量米非司酮對體外培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，探討米非司酮與卵泡發(fā)育的關系及臨床應用米非司酮治療子宮內膜異位癥等激素依賴性疾病的可能機制，為米非司酮的臨床應用提供理論依據。 方法 選取4-5周齡未成年SD雌性大鼠，腹腔注射60單位的孕馬血清促性腺激素(PMS6)以刺激卵泡發(fā)育，48小時后處死大鼠取卵巢，機械法分離顆粒細胞，體外培養(yǎng)24小時貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基，并分別加入10<'-6> mol

2、/L(低劑量組)、10<'-5>mol/L(中劑量組)、10<'-4>mol/L(高劑量組)的米非司酮繼續(xù)培養(yǎng)24小時，對照組為空白組。通過電鏡下超微結構觀察對顆粒細胞進行鑒定，運用流式細胞術結合熒光染色,(Hoechst 33342)了解不同濃度米非司酮對顆粒細胞形態(tài)學及生物學的影響，免疫細胞化學法觀察不同濃度米非司酮下顆粒細胞中Fas的表達，化學發(fā)光法測定不同濃度米非司酮處理顆粒細胞后的雌二醇和孕酮水平。 用One-way

3、ANOVA和LSD法檢驗的統計學方法進行處理組與對照組及兩兩組間數據比較分析，方差不齊則選用調整方差齊性的dunnett檢驗進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05，雙側。所有實驗數據采用SPSS11.5統計軟件包進行處理。 結果: 1.原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞，活細胞數量可達90％以上，體外培養(yǎng)24小時后，顆粒細胞貼壁生長，胞質富含顆粒，細胞間出現纖維性連接。透射電鏡下可看到所收集細胞中顆粒細胞達80％～85％，其特征性的超

4、微結構：胞質內出現管狀嵴線粒體，滑面內質網(SER)豐富，出現電子密度較高的類脂滴。 2.流式細胞術檢測結果顯示，隨米非司酮濃度增加，顆粒細胞凋亡率增加，低劑量組(6.7％±0.73％)與對照組(7.5％±0.88％)間差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組(9.53％±0.78％)、高劑量組(13％±1.75％)與對照組間差異有統計學意義(P<0.05)，各處理組間有統計學差異(P<0.05)。進一步結合熒光顯微鏡觀察細胞

5、凋亡情況，細胞核致密濃染的凋亡細胞數量隨米非司酮劑量增加而增多，細胞凋亡率低劑量組(4.18％±0.90％)與對照組(1.49±2.20％)間無統計學差異(P>0.05)，中劑量組(6.63％±1.48％)、高劑量組(15.45％±3.89％)與對照組間有統計學差異(P<0.05)，各處理組之間有統計學差異(P<0.05)。 3.免疫細胞化學結果顯示：顆粒細胞中Fas蛋白表達隨米非司酮處理劑量的增加而增強，陽性表達率低劑量組(0

6、.2902±0.0652)、中劑量組(0.3639±0.0748)、高劑量組(0.5572±0.0673)與對照組(0.1944±0.0818)之間差異有統計學意義(P<0.01)，各組間均有差異(P<0.05)。 4. 離體顆粒細胞孕酮的水平隨米非司酮濃度增加而降低。低劑量組(2.27±0.55pg/ml)、中劑量組(0.56±0.16 pg/ml)、高劑量組(0.18±0.08 pg/ml)與對照組(7.67±1.67 pg

7、/ml)之間有差異(P<0.01)，各處理組間差異有統計學意義(P<0.05)：雌二醇水平沒有受到明顯影響，組間統計學上無差異(P>0.05)。 結論 1．米非司酮可誘導顆粒細胞發(fā)生凋亡，離體顆粒細胞凋亡率隨米非司酮劑量增加而增高，可能是米非司酮抑制卵泡發(fā)育和激素水平，治療子宮內膜異位癥等激素依賴性疾病的機制之一。 2．米非司酮可能通過調節(jié)顆粒細胞表面凋亡因子Fas蛋白的表達而誘導顆粒細胞凋亡，從而影響孕酮的分泌