辛硫磷與氰戊菊酯對(duì)體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素合成的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、第一部分辛硫磷與氰戊菊酯對(duì)體外培養(yǎng)rGCs類固醇激素合成的影響.為了探討Fen與Pho單劑對(duì)激素合成以及激素合成酶mRNA和蛋白表達(dá)的影響,我們采用無(wú)血清培養(yǎng)的rGCs作為模型.rGCs取自未成年Sprague-Dawley大鼠(20-25天齡),細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)并稍作修改.細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中后,Fen及Pho分別以不同的濃度(0,1,5,25,125和625μmol/L)進(jìn)行染毒,染毒時(shí)間為24h.根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),在部分培

2、養(yǎng)液中加入卵泡刺激素(FSH)500μg/L、forskolin 10μmol/L、22(R)-羥膽固醇(22R-HC)25 μmol/L、蛋白激酶抑制劑(PKI)2μmol/L以及8-Bromo-cAMP 1 mmol/L.染毒結(jié)束后,收集培養(yǎng)上清凍存于-20℃?zhèn)溆?待測(cè)孕酮(P<,4>)和17β-雌二醇(E<,2>)濃度.細(xì)胞內(nèi)cAMP采用無(wú)水乙醇法進(jìn)行提取.另外的實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞總RNA及蛋白質(zhì)也分別進(jìn)行抽提以進(jìn)行RT-PCR(或?yàn)閞e

3、al time PCR)以及Western'blot檢測(cè).結(jié)果表明Fen與Pho均能干擾原代培養(yǎng)rGCs的激素合成,其機(jī)制可能涉及到了細(xì)胞內(nèi)cAMP-依賴的蛋白激酶信號(hào)通路;同時(shí),一些激素合成酶及相關(guān)蛋白(P450scc、StAR和P450arom)表達(dá)的改變可能也起了一定的作用.第二部分基因芯片技術(shù)分析體外培養(yǎng)rGCs經(jīng)氰戊菊酯處理后基因表達(dá)的變化.為了解經(jīng)Fen處理后rGCs內(nèi)基因變化的情況,我們從處理后的細(xì)胞中抽提出總RNA,然后

4、用Affymetrix Genechip RAT 230A寡核苷酸芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜掃描.rGCs的染毒劑量為25μmol/L,對(duì)照組培養(yǎng)液中加入0.1﹪無(wú)水乙醇.染毒后根據(jù)不同的時(shí)間段于6h、12h和24h收集細(xì)胞,抽提純化總RNA,并進(jìn)行一系列的處理,然后與約含15900個(gè)大鼠表達(dá)基因的RAT 230A芯片進(jìn)行雜交.與對(duì)照組相比,所有處理組內(nèi)表達(dá)變化超過(guò)2倍的上調(diào)基因數(shù)目分別為:6h,168個(gè)基因;12h,97個(gè)基因;24h,140