氰戊菊酯對(duì)類固醇激素合成的影響及相關(guān)信號(hào)通路的研究.pdf

1、近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)或內(nèi)分泌干擾化學(xué)物(EDCs)對(duì)人類生殖健康的影響已引起各國(guó)政府和許多學(xué)者的普遍關(guān)注。在美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(USEPA)公布的EDCs中，農(nóng)藥)L-乎占了三分之二。中國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥生產(chǎn)和使用量逐年增加，其中氰戊菊酯作為一種常用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，因其能在環(huán)境中相對(duì)快速降解等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。然而，很多研究結(jié)果表明，氰戊菊酯可以對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。本研究利用體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞株(

2、MLTC-1)為染毒模型，側(cè)重于研究氰戊菊酯對(duì)孕酮合成的影響，并初步探討了cAMP和IGF信號(hào)通路在氰戊菊酯暴露導(dǎo)致類固醇激素合成變化中的作用。 第一部分氰戊菊酯對(duì)類固醇激素合成的影響目的觀察氰戊菊酯對(duì)類固醇激素合成的影響。 方法： 1.采用體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞株(MLTC-1)作為染毒模型。 2.MTT法測(cè)定氰戊菊酯對(duì)MLTC-1細(xì)胞活力的影響，確定染毒劑量。 3.不同濃度氰戊菊酯染毒M

3、LTC-1 24h，在培養(yǎng)液中加入hCG(0.1U/L)繼續(xù)染毒4h，用放射免疫法(RIA)檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的孕酮水平。 4.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1 24h，吸棄培養(yǎng)液，繼續(xù)用不合氰戊菊酯的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)培養(yǎng)4h，RIA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的孕酮水平。 結(jié)果： 1.根據(jù)MTT結(jié)果確定氰戊菊酯染毒劑量分別為：0、1、5、25和125μmol/L。 2.在hCG刺激下，氰戊菊

4、酯顯著抑制孕酮的合成，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。在125μmol/L組，孕酮下降了87.6％。 3.撤藥繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各劑量組的孕酮水平無顯著性差異。 結(jié)論：氰戊菊酯顯著抑制MLTC-1類固醇激素的合成，撤藥后MLTC-1細(xì)胞合成類固醇激素的能力基本恢復(fù)。 第二部分氰戊菊酯抑制孕酮合成與cAMP依賴的蛋白激酶信號(hào)通路目的初步探討cAMP信號(hào)通路在氰戊菊酯抑制孕酮合成中的作用。 方法： 1.不同濃度氰戊菊酯染

5、毒MLTC-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)液中分另《加入CT(30ng/ml)、forskolin(10μmol/L)和hCG(0.1U/L)繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的孕酮和cAMP水平。 2.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)液中分別加入8-Br-cAMP(500μmol/L)、22R-HC(25μmol/L)和孕烯醇酮(10μmol/L)繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的孕酮水平。 3.re

6、al-time RT-PCR測(cè)定類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)mRNA表達(dá)水平的變化。 4.蛋白印跡法(western blot)測(cè)定StAR、P450scc蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.在CT或forskolin刺激下，氰戊菊酯均顯著抑制孕酮的合成。 2.在hCG刺激下，氰戊菊酯顯著抑制MLTC-1細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。但在CT或forskolin的刺激下，

7、這種抑制作用消失。 3.培養(yǎng)液中加入8-Br-cAMP后，氰戊菊酯仍抑制孕酮的合成。 4.在培養(yǎng)液中加入22R-HC后，氰戊菊酯仍抑制孕酮的合成；而加入孕烯醇酮之后，氰戊菊酯對(duì)孕酮的抑制作用消失。 5.氰戊菊酯染毒MLTC-1細(xì)胞24h后，StAR mRNA和蛋白水平均下降。 6.氰戊菊酯染毒MLTC-1細(xì)胞24h后，P450scc mRNA和蛋白水平均呈劑量，效應(yīng)關(guān)系下降。 結(jié)論：氰戊菊酯顯著抑

8、制MLTC-1細(xì)胞孕酮的合成，其機(jī)制可能涉及cAMP-依賴的蛋白激酶信號(hào)通路。此外，氰戊菊酯還抑制膽固醇的跨線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)及P450scc的活性。 第三部分氰戊菊酯抑制孕酮合成與IGF信號(hào)通路目的初步探討IGF信號(hào)通路在氰戊菊酯抑制孕酮合成中的作用。 方法： 1.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)染毒4h，RT-PCR檢測(cè)IGF-1 mRNA的水平的變化。 2.不同濃度氰戊菊酯染毒M

9、LTC-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)液中分別加入hCG、hCG+LY294002、hCG+U0126繼續(xù)染毒4h，RIA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的孕酮水平。 3.不同濃度氰戊菊酯染毒MLTC-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)液中加入hCG繼續(xù)染毒，western blot測(cè)定ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.隨著氰戊菊酯染毒濃度的增加，在1μmol/L和更高劑量組，IGF-I mRNA的量顯著降低。 2.培養(yǎng)液中加