β-catenin在豬卵巢組織中的表達以及對豬卵巢顆粒細胞凋亡及類固醇生成酶的影響.pdf

1、以β-catenin為關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導分子的Wnt信號轉(zhuǎn)導通路在雌性發(fā)育過程中有重要作用,其表達缺失或者突變都會引起Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導紊亂,從而對機體組織或細胞產(chǎn)生重要影響。敲除Wnt4可導致小鼠在出生前部分的性反轉(zhuǎn)以及卵母細胞的衰竭,在敲除β-catenin的小鼠顆粒細胞中形成內(nèi)含紊亂和多形性粒層細胞的卵泡樣結(jié)構(gòu),可導致顆粒細胞癌的發(fā)生。近來發(fā)現(xiàn),β-catenin參與了促性腺激素釋放激素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò),對激素生成有重要作

2、用。
　　 本研究以二花臉、皮特蘭,商品雜種豬的卵巢以及豬卵巢顆粒細胞為實驗材料,利用real time RT-PCR檢測了不同豬種卵巢內(nèi)β-catenin以及不同生長時期卵泡與卵巢顆粒細胞、卵母細胞內(nèi)β-catenin的表達水平；利用RNAi方法敲減β-catenin,同時利用LiCl拮抗GSK-3β對β-catenin的磷酸化、降解作用,使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量積聚的原理,用LiCl持續(xù)處理顆粒細胞使之過表達。利用流式

3、細胞術(shù)、real time RT-PCR、western blot等方法從沉默和過表達兩個方面研究β-catenin基因?qū)ωi卵巢顆粒細胞凋亡以及類固醇激素合成酶的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1利用real time RT-PCR法檢測不同品種豬卵巢以及不同生長時期豬卵泡及卵巢顆粒細胞、卵母細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導分子β-catenin的表達情況,結(jié)果表明:β-catenin在不同品

4、種豬卵巢中有差異表達,二花臉豬卵巢內(nèi)的β-catenin表達量是普通商品豬卵巢的近3倍(p<0.05),而皮特蘭豬巢內(nèi)的β-catenin表達量只有普通商品豬卵巢的40％。β-catenin在卵泡的不同發(fā)育階段有差異表達,大卵泡中β-catenin表達量顯著高于中卵泡和小卵泡(p<0.05)。β-catenin在卵巢顆粒細胞和卵母細胞中亦有差異表達,顆粒細胞中β-catenin含量是卵母細胞中的近2.5倍(p<0.05)。
　　

5、 2為了研究Wnt/β-catenin信號通路在豬卵泡顆粒細胞中的作用,本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細胞(pGCs)進行體外培養(yǎng)?；讦?catenin在該通路中的核心地位,分別采用RNAi技術(shù)“沉默”豬β-catenin基因,阻抑Wnt/β-catenin信號通路,LiCl處理激活Wnt/β-catenin信號通路以檢測β-catenin對豬卵泡顆粒細胞凋亡和類固醇激素合成的影響。結(jié)果表明:(1)采用的RNAi技術(shù)成功地

6、“敲減”豬β-catenin基因,在mRNA水平該基因被下調(diào)59.93％(p<0.05),蛋白水平被下調(diào)。建立了Wnt/β-catenin信號通路阻抑的細胞模型。敲減β-catenin顯著增加細胞凋亡率,上調(diào)Bax的表達(32.76％,p<0.05),下調(diào)BCL-2的表達(44.28％,p<0.05),并下調(diào)P450arommRNA的表達(47.72％,p<0.05),但不影響P450scc的表達。(2)LiCl處理成功激活Wnt/β-

7、catenin通路,β-catenin在mRNA水平該基因被上調(diào)95.15％(p<0.05),蛋白水平被上調(diào)。建立了Wnt/β-catenin信號通路激活的細胞模型。過表達β-catenin顯著增加細胞凋亡率下調(diào)Bax的表達(25.60％,p<0.05),上調(diào)BCL-2的表達(12.58％,p>0.05),并上調(diào)P450arom mRNA(151.6％,P<0.05)和P450scc mRNA(124.3％,p<0.05)的表達。表明W