RegIV在PCOS模型大鼠卵巢中的表達(dá)及對顆粒細(xì)胞作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，臨床特征為持續(xù)無排卵、高雄激素血癥以及超聲下見卵巢呈多囊樣改變，其發(fā)生糖尿病、高血壓、心血管疾病及子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險增加。在閉經(jīng)患者中約占30％，在月經(jīng)稀少和排卵功能障礙性不孕患者中可高達(dá)90％。目前，該病機(jī)制仍不是很清楚。有研究認(rèn)為卵泡生長發(fā)育異?？赡苁且餚COS不排卵及臨床內(nèi)分泌改變的病理基礎(chǔ)，而內(nèi)在性的卵泡發(fā)育異?？赡芘c卵

2、巢顆粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控失常有關(guān)。此外，卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡與卵泡的發(fā)育成熟及閉鎖密切相關(guān)，多種調(diào)控因子參與顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的過程。
　　再生基因Reg家族，屬鈣依賴性凝集素超家族(calcium-dependentlectin superfamily)，代表一組小分子、多功能的分泌性蛋白。1984年由法國人Keim首先在急性胰腺炎的大鼠胰液中發(fā)現(xiàn)，其功能相當(dāng)于急性反應(yīng)蛋白和胰腺β細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及消化系統(tǒng)上皮細(xì)胞等的抗凋亡因子

3、或生長因子。根據(jù)Reg基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)，Reg家族可分為4個亞型:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。主要參與組織損傷、炎癥及糖尿病和腫瘤的發(fā)生。RegⅣ基因作為Reg基因家族的新成員，由Hanupee等于2001年在研究炎癥性腸病時首次分離篩選鑒定并報道。該基因定位于1號染色體(1q12-q21)，由17496個堿基對構(gòu)成，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。其蛋白相對分子質(zhì)量約17 kDa。大量研究表明RegⅣ參與細(xì)胞的增殖、凋亡、再生和炎性、化生反應(yīng)，

4、并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而對于RegⅣ的生物學(xué)功能的研究還不是很透徹，它是否在卵巢中表達(dá)并參與卵泡的發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的凋亡和增殖等都未見任何報導(dǎo)。因此，本研究首先通過免疫組織化學(xué)染色、定量RT-PCR以及Western blot分析觀察RegⅣ在正常和PCOS模型大鼠卵巢的表達(dá)情況，以探討RegⅣ是否與PCOS的發(fā)病相關(guān)。此外，RegⅣ觸發(fā)的信號通路、靶點(diǎn)、與其它級聯(lián)的交叉以及與其它因子的相互作用和影響仍不清楚，所以我們接著采用

5、大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，研究外源性的RegⅣ蛋白對顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并應(yīng)用小分子RNA干擾技術(shù)抑制RegⅣ表達(dá)，進(jìn)一步探討RegⅣ對EGFR/Akt及IGF-Ⅰ/Akt信號通路及凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。
　　吳茱萸(Evodia rutaecarpa)為蕓香科植物吳茱萸及其變種石虎和疏毛吳茱萸干燥的近成熟果實(shí)。其藥理作用比較多:如鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、降壓、抗缺氧等。吳茱萸堿（Evodiamine，e

6、vo）作為其主要生物堿之一，具有多種藥理學(xué)效應(yīng)，如降低體重、抗炎、降低血糖，改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)體溫、抑制腫瘤生長、鎮(zhèn)痛及對心血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用。多囊卵巢綜合征病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)分泌、神經(jīng)、代謝等諸多方面。PCOS患者中肥胖的比例超過50％，胰島素抵抗發(fā)生率為50％-70％，占發(fā)病患者的絕大部分。長期以來，有關(guān)多囊卵巢綜合征的治療方案已有許多研究和改進(jìn)，但是臨床效果仍不夠理想。而目前吳茱萸堿在婦科生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域的研究還很少，所

7、以本課題還將初步探討吳茱萸堿對多囊卵巢綜合征模型大鼠的作用，并進(jìn)一步研究其對PCOS模型大鼠卵巢RegⅣ表達(dá)的影響及機(jī)制，以及Evo對體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中RegⅣ作用的影響。這些將為開發(fā)新的治療多囊卵巢綜合征的藥物和指導(dǎo)臨床治療提供新的策略，同時也為我們進(jìn)一步研究多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究共分為如下四個部分:
　　第一部分:RegⅣ基因在正常大鼠生殖系統(tǒng)的表達(dá)及意義。
　　目的：探討RegⅣ在大鼠卵巢和子宮中

8、的表達(dá)情況。方法：通過RT-PCR和Western blotting方法，分別從mRNA和蛋白水平來分析RegⅣ的表達(dá)。通過免疫組化染色分析RegⅣ蛋白在大鼠卵巢和子宮中的表達(dá)定位。結(jié)果：RegⅣ在卵巢的表達(dá)顯著高于其在子宮的表達(dá)。在大鼠卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞、黃體和間質(zhì)細(xì)胞中觀察到RegⅣ的強(qiáng)染色信號，尤其在顆粒細(xì)胞中表達(dá)明顯。在大鼠子宮中，僅僅在內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細(xì)胞中檢測到弱的RegⅣ染色信號。結(jié)論：RegⅣmRNA和蛋白在

9、正常大鼠生殖系統(tǒng)器官卵巢和子宮中均有表達(dá)，提示RegⅣ可能在生殖系統(tǒng)細(xì)胞生長和增殖中具有潛在作用。
　　第二部分:RegⅣ基因在PCOS模型大鼠卵巢中的表達(dá)。
　　目的：探討RegⅣ在PCOS模型大鼠卵巢組織中的表達(dá)情況。方法：采用Poretsky法用INS聯(lián)合HCG誘導(dǎo)SD大鼠建立PCOS模型，觀察大鼠體重變化及卵巢相對重量;放免分析法測定血清T、LH、FSH、E2、INS水平;HE染色觀察卵巢形態(tài)改變;免疫組織化學(xué)方法檢

10、測RegⅣ及相關(guān)因子EGFR、IGF-Ⅰ蛋白在卵巢組織的定位表達(dá);定量RT-PCR和Western blotting分別檢測RegⅣ及相關(guān)因子EGFR、IGF-Ⅰ在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：RegⅣ表達(dá)于大鼠卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞以及黃體等部位;EGFR明顯表達(dá)于大鼠卵巢卵泡顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、卵巢間質(zhì)以及黃體顆粒細(xì)胞等;IGF-Ⅰ在正常大鼠卵巢卵泡顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和黃體顆粒細(xì)胞有表達(dá)。PCOS模型組卵巢中RegⅣ和IGF-

11、Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)均低于正常對照組(P＜0.05)，而EGFR mRNA及蛋白表達(dá)高于正常對照組（P＜0.05）。結(jié)論：RegⅣ的表達(dá)下調(diào)可能與PCOS的發(fā)病有關(guān)，且與IGF-Ⅰ、EGFR可能存在相互作用。
　　第三部分:RegⅣ對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的作用及機(jī)制。
　　目的：探討RegⅣ對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響及信號通路。方法：采用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，通過MTT法研究外源性的RegⅣ蛋白對顆粒細(xì)胞增殖

12、與凋亡的影響，并應(yīng)用小分子RNA干擾技術(shù)抑制RegⅣ表達(dá)，進(jìn)一步運(yùn)用Western blotting檢測RegⅣ對EGFR/Akt及IGF-Ⅰ/Akt信號通路及凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果：不同濃度的RegⅣ蛋白對顆粒細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，并隨時間的延長和濃度的增加而增強(qiáng)。100 nM RegⅣ-siRNA2在轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h后阻斷RegⅣ蛋白的表達(dá)最明顯。用RegⅣ蛋白作用卵巢顆粒細(xì)胞后，IGF-Ⅰ、EGFR、

13、pEGFR、pAkt及Bcl-2的表達(dá)增加;與此同時，RegⅣ-siRNA轉(zhuǎn)染后的顆粒細(xì)胞則表現(xiàn)相反，IGF-Ⅰ、EGFR、pEGFR、pAkt及Bcl-2的表達(dá)明顯減少，而Bax的表達(dá)則明顯增加。結(jié)論：RegⅣ能夠通過增加IGF-Ⅰ、EGFR的表達(dá)激活A(yù)kt信號通路，引起下游Bcl-2表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖;當(dāng)阻斷RegⅣ的表達(dá)后，IGF-Ⅰ、EGFR表達(dá)受到影響，活化Akt減少，引起下游Bcl-2表達(dá)減少和Bax表達(dá)增加，從而

14、促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡增加。我們推測RegⅣ蛋白可能是EGFR/Akt和IGF-Ⅰ/Akt信號通路的潛在激活劑。
　　第四部分:吳茱萸堿對PCOS模型大鼠及RegⅣ作用的影響。
　　目的：觀察吳茱萸堿對PCOS大鼠及RegⅣ在卵巢和顆粒細(xì)胞中功能的影響。方法：選用Poretsky PCOS動物模型，觀察大鼠的體重、動情周期、血清性激素、胰島素水平以及病理組織學(xué)變化。通過定量RT-PCR和Western blotting方法，分別從

15、mRNA和蛋白水平來分析RegⅣ、EGFR及IGF-Ⅰ的表達(dá)變化。通過免疫組化染色分析RegⅣ、EGFR及IGF-Ⅰ蛋白在大鼠卵巢中的表達(dá)定位。此外，用MTT法檢測Evo對顆粒細(xì)胞中RegⅣ作用的影響。結(jié)果：吳茱萸堿能降低PCOS模型大鼠的體重、維持其動情周期、降低血清T、LH和INS水平;卵巢卵泡壁顆粒細(xì)胞層數(shù)和黃體數(shù)量增加。PCOS模型組大鼠卵巢組織中RegⅣ和IGF-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常對照組降低。與PCOS模型組相比

16、，經(jīng)過藥物干預(yù)治療處理，Evo低劑量組、二甲雙胍組、Evo高劑量組中RegⅣ和IGF-Ⅰ的表達(dá)水平逐漸提高。然而，PCOS組大鼠卵巢中EGFRmRNA和蛋白的表達(dá)水平較正常對照組明顯增加。與PCOS模型組相比，Evo低劑量組、Evo高劑量組、二甲雙胍組中EGFR的表達(dá)水平逐漸降低。將不同濃度的Evo與RegⅣ蛋白共培養(yǎng)，隨著Evo濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，對顆粒細(xì)胞增殖開始出現(xiàn)抑制。結(jié)論：吳茱萸堿具有降低體重、降低血清T、LH和INS