PCOS患者黃素化顆粒細(xì)胞上血管緊張素受體的表達(dá)及AngⅡ、Ang1-7對(duì)顆粒細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　 通過檢測(cè)行體外受精-胚胎移植的多囊卵巢綜合征患者(polycysticovarysyndromePCOS)及正常月經(jīng)周期患者卵巢顆粒細(xì)胞上血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)、血管緊張素Ⅱ受體2(AT2)、血管緊張素1-7受體(MAS)表達(dá)的差異，探討其是否參與PCOS發(fā)病;通過使用不同濃度的AngⅡ、Ang1-7作用于卵巢顆粒細(xì)胞，了解其對(duì)顆粒細(xì)胞增殖分泌功能的影響，探討其在局部卵巢組織中的生理病理作用。
　　

2、方法:
　　 1、人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞收集取自2011年11月-2012年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的卵泡穿刺術(shù)患者21例，年齡24～38歲?；颊呔鶠殚L(zhǎng)周期促排卵方案者，定期監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑＞17mm時(shí)，肌肉注射10000IUhCG，于注射34-36h后，B超下經(jīng)陰道穿刺卵泡采集卵母細(xì)胞，同時(shí)收集卵泡液。
　　 對(duì)照組為因輸卵管不通或者因男方因素不孕的女性11例

3、，這些患者平素月經(jīng)規(guī)則，排卵功能及盆腔超聲檢查無異常，均排除其他的內(nèi)分泌疾病，行IVF-ET前3個(gè)月內(nèi)無激素類藥物應(yīng)用史，無心、肝、腎等疾病病史;
　　 實(shí)驗(yàn)組為多囊卵巢綜合征患者10例，PCOS的診斷參照2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[1]:①稀發(fā)排卵或不排卵;②高雄激素血癥表現(xiàn);③卵巢多囊樣改變（一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2-9mm的卵泡＞12個(gè)，或（和）卵巢體積≥10ml)，以上三項(xiàng)中具備兩項(xiàng)即可診斷。同時(shí)排除腎上腺或垂體等其他內(nèi)分泌疾病，

4、且患者近3個(gè)月內(nèi)無激素類藥物應(yīng)用史，無心、肝、腎疾病史。
　　 2、體外培養(yǎng)正常月經(jīng)周期及PCOS患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞72小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞AT1、AT2、MASmRNA水平的表達(dá);
　　 3、以10-10～10-5mmol/L濃度的AngⅡ、Ang1-7作用于人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞24、48、27小時(shí)，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)法測(cè)OD值，檢測(cè)AngⅡ、Ang1-7對(duì)顆粒細(xì)胞增殖功能的影響;
　　

5、4、以10-6mmol/L濃度的AngⅡ、Ang1-7作用于人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞24、48、72小時(shí)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上清液中雌激素(E2)、孕激素(P)的濃度，間接了解AngⅡ、Ang1-7對(duì)顆粒細(xì)胞功能的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況:細(xì)胞成活率達(dá)90％以上。細(xì)胞培養(yǎng)24h內(nèi)貼壁、增殖;培養(yǎng)2d后明顯增殖，2-5d時(shí)處于分裂高峰;6-7d逐漸變形、退化。培養(yǎng)第3d經(jīng)HE染色可見

6、細(xì)胞核大、圓，細(xì)胞質(zhì)透光性好、富含顆粒及空泡，核染深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。
　　 2、RT-PCR法檢測(cè)AT1、AT2、MASmRNA的結(jié)果
　　 2.1、AT1mRNA的表達(dá)
　　 正常月經(jīng)周期患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞與PCOS患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞中均有AT1mRNA表達(dá)，AT1mRNA表達(dá)的結(jié)果分別為2.895±0.9625、5.266701±1.7663，PCOS患者組AT1mRNA明顯高于正常月經(jīng)周期組，

7、且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.2、AT2mRNA的表達(dá)
　　 正常月經(jīng)周期患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞與PCOS患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞中均有AT2mRNA表達(dá)，AT1mRNA表達(dá)的結(jié)果分別為1.8662±0.669、5.9741±2.1063，PCOS患者組AT2mRNA明顯高于正常月經(jīng)周期組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.3、MASmRNA的表達(dá)
　　 正常月經(jīng)周期患者卵巢

8、黃素化顆粒細(xì)胞與PCOS患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞中均有MASmRNA表達(dá)，MASmRNA表達(dá)的結(jié)果分別為0.5337±0.1974、1.4830±0.2593，PCOS患者組MASmRNA明顯高于正常月經(jīng)周期組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、MTT檢測(cè)結(jié)果
　　 3.1、AngⅡ作用于顆粒細(xì)胞后MTT檢測(cè)結(jié)果
　　 10-10～10-5mmol/L的AngⅡ作用24、48、72小時(shí)，其吸光度(OD

9、)均較對(duì)照組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　 10-9～10-6mmol/L濃度組隨著濃度的增加AngⅡ抑制細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，以10-6mmol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng);
　　 3.2、Ang1-7作用于顆粒細(xì)胞后MTT檢測(cè)結(jié)果:
　　 10-10～10-5mmol/L的Ang1-7作用于顆粒細(xì)胞24、48、72小時(shí)，OD值均較對(duì)照組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 10-9～1

10、0-6mmol/L濃度組隨著濃度的增加Ang1-7抑制細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，以10-6mmol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng);
　　 3.3、隨時(shí)間延長(zhǎng)MTT檢測(cè)結(jié)果
　　 隨AngⅡ、Ang1-7作用時(shí)間延長(zhǎng)（24、48、72小時(shí)），OD值逐漸增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 4、AngⅡ、Ang1-7作用于顆粒細(xì)胞后上清液E2、P濃度:
　　 4.1、與對(duì)照組相比，AngⅡ、Ang1-7組作用2

11、4、48、72小時(shí)后，顆粒細(xì)胞上清液中E2濃度增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩藥物間E2濃度無明顯差異(P＞0.05）;
　　 4.2、與對(duì)照組相比，AngⅡ、Ang1-7組作用24、48、72小時(shí)后，顆粒細(xì)胞上清液中P濃度無明顯變化(P＞0.05)。兩藥物間P濃度也無明顯差異（P＞0.05）;
　　 4.3、隨作用時(shí)間延長(zhǎng)(24、48、72小時(shí))，各組E2、P均增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

12、r>　　 結(jié)論:
　　 1、密度梯度離心法體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞成活率較高;
　　 2、PCOS患者卵巢黃素化顆粒細(xì)胞上AT1、AT2、MAS的分子表達(dá)更強(qiáng)，其可能參與了PCOS的病理過程;
　　 3、生理劑量的AngⅡ(10-10mmol/L)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，10-6mmol/L濃度時(shí)抑制作用最強(qiáng);生理劑量的Ang1-7抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，10-6mmo