人卵巢壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子的研究.pdf

1、本文對(duì)人卵巢壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子進(jìn)行了研究，文章主要分以下幾部分展開： 第一部分人卵巢黃素化壁層顆粒細(xì)胞多種細(xì)胞因子的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性及臨床妊娠的關(guān)系 【研究目的】 研究在體外受精一胚胎移植過程中獲取的人卵巢黃素化壁層顆粒細(xì)胞(mural granulosa cells，MGC)分泌IL-1α、IL-1α、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin和bFGF，探討多種

2、細(xì)胞因子表達(dá)水平與超促排卵的卵巢反應(yīng)性及臨床妊娠的關(guān)系。 【材料和方法】 1．壁層顆粒細(xì)胞標(biāo)本人黃素化壁層顆粒細(xì)胞取自2006年3月至9月在南方醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療婦女的卵泡液，共32例，均為輸卵管因素或男方因素不孕者。 2．壁層顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)經(jīng)拾卵后的所有卵泡穿刺液，用Percoll梯度離心法分離壁層顆粒細(xì)胞。根據(jù)取卵時(shí)平均直徑在14mm以上的卵泡數(shù)不同，將患者分為卵巢高反應(yīng)、正常反應(yīng)和低反應(yīng)3種類

3、型，即高反應(yīng)型卵泡數(shù)=14個(gè)，正常反應(yīng)型卵泡數(shù)5～13個(gè)，低反應(yīng)型卵泡數(shù)=4個(gè)。按胚胎移植后35天B超檢查見胎心搏動(dòng)分為妊娠組，反之，為未妊娠組。 3．Luminex system(LumAvidin Beads)檢測(cè)運(yùn)行Luminex檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中9種細(xì)胞因子：IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的濃度。 【統(tǒng)計(jì)方法】 利用SPSS10.0軟

4、件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較≤35歲和≥36歲組，妊娠組和非妊娠組組間因子水平的差異。方差分析分析卵巢反應(yīng)組間因子表達(dá)量的差異，用偏相關(guān)分析各細(xì)胞因子表達(dá)量之間，細(xì)胞因子與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)和雌二醇之間的相關(guān)性。P=0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)果】 1．≤35歲組與≥36歲組的IVF患者M(jìn)GC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.05)。 2. IL-1a、IL-6、V

5、EGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切。IL-1β、bFGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切(P=0.05)。 3．根據(jù)取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)不同進(jìn)行卵巢反應(yīng)性分組，卵泡直徑為14mm以上的卵泡數(shù)≤3個(gè)為卵巢低反應(yīng)組，卵泡數(shù)4～13個(gè)為卵巢中反應(yīng)組，≥14個(gè)為卵巢高反應(yīng)組。在卵巢反應(yīng)分組中，IL-1a、IL-1β、IL-1ra、lL-6、VEGF、lcptin和bFGF在組間有顯著差異(P=0.05)，余因

6、子水平未見差異(P>0.05)。 4．在卵巢正常反應(yīng)組中，IL-1α和IL-6，IL-1β和IL-1ra、IL-6，IL-1ra與IL-6，IL-6與VEGF相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切(P=0.05)。IL-6和leptin負(fù)相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切(P=0.05)。 5．妊娠組與非妊娠組的獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組比較，前者M(jìn)GC的IL-1ra、EGF分泌水平低于后者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，而I

7、L-1a、IL-1β、IL-6、VEGF水平高于后者，余因子水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 【結(jié)論】 1．隨著年齡的增加，高齡患者的MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF降低。 2．IL-1α、IL-1βB、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在不同的卵巢反應(yīng)組間有顯著差異，提示上述細(xì)胞因子與超促排卵的卵巢反應(yīng)性有關(guān)。高反應(yīng)組的MGC分泌更多的細(xì)胞因子。 3．通過IVF治療獲得妊

8、娠的婦女比未妊娠者M(jìn)GC分泌更高的IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，而IL-1ra和EGF則相反。提示IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，有利于卵母細(xì)胞發(fā)育及以后的胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。 4．Lumincx液相蛋白芯片分析系統(tǒng)具有靈活性好、通量大、靈敏度高、信噪比好的特點(diǎn)，能同時(shí)檢測(cè)到同一樣本多個(gè)極微量的分子蛋白，比其它的檢測(cè)方法具有更多優(yōu)勢(shì)。 第二部分人卵丘細(xì)胞多種細(xì)胞因子的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性及臨床妊娠的關(guān)系

9、 【研究目的】 研究體外培養(yǎng)的卵丘細(xì)胞(cumulus cells，CC)分泌IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、lcptin、bFGF的水平，探討上述多種細(xì)胞因子表達(dá)與卵巢反應(yīng)性及臨床妊娠的關(guān)系。 【材料和方法】 1．卵丘細(xì)胞標(biāo)本人卵丘顆粒細(xì)胞取自在南方醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的婦女，共13例，均為輸卵管因素或男方因素不孕者。 2．卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)取

10、卵后，機(jī)械法分離卵子周圍的卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)，用0.1％透明質(zhì)酸酶消化并用吸管反復(fù)吹打直至將卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)分散為單個(gè)細(xì)胞。按活細(xì)胞1×10<'4>/mL密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每瓶加1mL細(xì)胞懸液。加入含10％小牛血清的RPMI-1640液1mL后，在95％空氣、5％CO<,2>、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換無血清RPMI-1640液，24小時(shí)后收集上清液。 3． LumiRex system(LumAvidin B

11、eads)檢測(cè)方法同第一部分【統(tǒng)計(jì)方法】 利用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較妊娠組和非妊娠組組間因子水平的差異。方差分析分析卵巢反應(yīng)組間因子表達(dá)量的差異，用偏相關(guān)分析各細(xì)胞因子表達(dá)量之間，細(xì)胞因子與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)和雌二醇之間的相關(guān)性。P=0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)果】 1．CC分泌的IL-1ra與成熟卵子數(shù)相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切(P=0.05)；VEGF與獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二

12、醇相關(guān)關(guān)系顯著，相關(guān)密切(P=0.05)。 2．根據(jù)取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)不同進(jìn)行卵巢反應(yīng)性分組，卵泡直徑為14mm以上的卵泡數(shù)≤3個(gè)為卵巢低反應(yīng)組，卵泡數(shù)4～13個(gè)為卵巢中反應(yīng)組，≥14個(gè)為卵巢高反應(yīng)組。三組患者間年齡無差異(P>0.05)。VEGF在組間有顯著差異(P=0.05)，余因子水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3．妊娠組與非妊娠組的年齡、獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇及孕酮均沒有差異(P>0.05)。兩組卵丘細(xì)胞

13、培養(yǎng)上清液中的9種細(xì)胞因子水平相近，均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 【結(jié)論】 1．體外培養(yǎng)的人卵丘細(xì)胞分泌的IL-1ra水平與成熟卵子數(shù)相關(guān)，VEGF與卵子數(shù)、成熟卵子數(shù)、雌二醇正相關(guān)，IL-1ra和VEGF可能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟。 2．年齡相似的不同卵巢反應(yīng)性組卵丘顆粒細(xì)胞的VEGF表達(dá)水平有顯著差異，而其它細(xì)胞因子未見差異，提示VEGF在卵巢對(duì)超促排卵的反應(yīng)性中發(fā)揮了重要作用。 3．卵丘細(xì)胞分

14、泌的上述9種因子與臨床妊娠率無明顯關(guān)系，提示卵丘細(xì)胞表達(dá)的上述9種因子不影響IVF-ET的臨床妊娠率。 第三部分促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)人卵巢壁層顆粒細(xì)胞多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 【研究目的】 研究在IVF-ET治療中使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)人卵巢壁層顆粒細(xì)胞分泌的IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF的調(diào)節(jié)作用，探討GnRHa在IVF-ET中應(yīng)用的安全性

15、。 【材料和方法】 1．壁層顆粒細(xì)胞標(biāo)本同第一部分。 2．壁層顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)MGC培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后，更換無血清RPMI-1640液，促性腺激素激動(dòng)劑(Gonadotrophinreleasing hormoneagonist，GnRHa)組為培養(yǎng)液中加入GnRHa，終濃度為100pg/ml。培養(yǎng)24h后，收集上清液。 3． Luminex system檢測(cè)同第一部分。 【統(tǒng)計(jì)方法】

16、 利用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較GnRHa組和對(duì)照組間因子水平的差異。P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)果】 比較加入GnRHa(實(shí)驗(yàn)組)體外培養(yǎng)的MGC分泌上述細(xì)胞因子并與未加GnRHa(對(duì)照組)。兩組間的獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、妊娠率無明顯差異(p>0.05)。兩組間的上述9種細(xì)胞因子分泌水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 【結(jié)論】 GnRHa對(duì)MGC表達(dá)IL-1α、I