大鼠BMSCs保護大鼠卵巢顆粒細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討大鼠BMSCs體內(nèi)、外保護大鼠卵巢顆粒細胞的情況。
　　 方法：從SD大鼠骨髓中提取MSCs，經(jīng)體外擴增、純化并進行鑒定。體外實驗，采用3周齡左右的雌性SD大鼠，皮下注射60單位的孕馬血清，48小時后無菌條件下取出雙側卵巢，用皮試針針頭在體視鏡下刺破各卵泡，沖出顆粒細胞。顆粒細胞在體外擴增、純化并進行鑒定。用MTT法得出順鉑對顆粒細胞的半抑制濃度及最佳干預時間。采用半抑制濃度的30％即5mg/l作為實驗的干預濃度，干預

2、時間為72h。體外實驗分為：G0組 顆粒細胞；G5組 顆粒細胞+5mg/l順鉑；GM5組 顆粒細胞+5mg/l順鉑+BMSCs. GM5組采用Millicell 共培養(yǎng)小室把顆粒細胞和BMSCs分上下兩層進行共培養(yǎng)，BMSCs分泌的細胞因子可以自由通過。實驗各組干預72h后，通過流式細胞術檢測各組顆粒細胞的凋亡率，RT-PCR技術檢測各組顆粒細胞凋亡相關基因的表達情況。體內(nèi)實驗分為四組：空白組、MSCs組、雌激素組、青年組。前三組采用9

3、～10月齡的SD雌性大鼠各15只，青年組采用15只3～4月齡的SD雌性大鼠。通過陰道脫離細胞監(jiān)測前三組圍絕經(jīng)模型鼠進入圍絕經(jīng)后，空白組通過尾靜脈輸注2ml的生理鹽水，一周后重復注射等量生理鹽水；MSCs組經(jīng)尾靜脈輸注2ml含1～2′106MSCs，一周后注射相同劑量細胞懸液；雌激素組灌用生理鹽水溶解的尼爾雌醇，按0.158mg/(kg.d)灌胃給藥，連續(xù)給藥8w；青年組采用3月齡左右的SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射2ml的生理鹽水，一周后重復注射

4、等量生理鹽水。實驗各組干預后第一、三個月，分別處死各組SD大鼠，取左側卵巢經(jīng)固定、切片做TUNEL凋亡染色，在顯微鏡下統(tǒng)計顆粒細胞的凋亡率。
　　 結果：體外實驗結果顯示：G0、G5、GM5各組凋亡率分別為0.59％、13.04％、4.84％。凋亡相關基因表達情況分別為：Survivn GO>GM5>G5；P21G5>GO>GM5；Cmy-c G0>GM5>G5；Bax G5>GO>GM5；Bcl-2 G0>GM5>G5。體內(nèi)實

5、驗結果顯示在干預一個月后實驗各組卵巢顆粒細胞的凋亡率分別為：空白組9.90±3.23％、MSC組6.10±2.63％（P=0.075）、雌激素組6.60±3.13％（P=0.139）、青年組1.53±1.44％（P=0.001）；干預三個月后實驗各組卵巢顆粒細胞的凋亡率分別為：空白組14.60±3.51％、BMSC組8.29±3.35％（P=0.02）、雌激素組10.53±2.29％（P=0.062）、青年組3.56±1.44％（P<0