靶向SMPD1基因的RNA干擾對卵巢顆粒細胞凋亡的保護作用研究.pdf

1、本研究針對人類SMPD1基因，設計合成了6對siRNA，分別以人成纖維細胞和顆粒細胞對其基因沉默效率進行篩選，獲得2對理想的siRNA，進一步檢測了它們在成纖維細胞中發(fā)揮作用的量效和時效關系。以絲裂霉素誘導的人卵巢顆粒細胞凋亡模型作為研究對象，按照摸索的最佳量效和時效關系，利用優(yōu)選的siRNA轉染細胞，觀察細胞活力和細胞凋亡的情況。結果顯示，siRNA對細胞毒性藥物引起的人卵巢顆粒細胞凋亡具有明顯的保護作用。本研究包括三個部分，詳述如下

2、： 第一部分細胞原代培養(yǎng)、鑒定及SMPD1的檢測 [目的]:分離、純化、培養(yǎng)人包皮成纖維細胞和人卵巢顆粒細胞，為進一步的siRNA篩選，沉默效率檢測及RNA干擾實驗提供細胞模型奠定方法學基礎。 [方法]: 1.應用胰酶及膠原酶聯(lián)合消化法進行原代人包皮成纖維細胞的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察和波形蛋白(Vimentin)免疫熒光檢測對其進行鑒定。 2.應用密度梯度離心及胰酶消化法進行原代人卵巢黃素化顆粒

3、細胞的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光法檢測對其進行鑒定。 3.通過RT-PCR檢測SMPD1基因的mRNA，免疫熒光檢測SMPD1的蛋白以確定兩種細胞內(nèi)源性表達靶基因。 [結果]:成纖維細胞貼壁生長，排列成束狀或漩渦狀。其波形蛋白陽性率達到96％。人卵巢顆粒細胞貼壁，呈星形生長，胞漿富含顆粒。FSHR的陽性率為75％～85％。兩種細胞均有SMPD1基因mRNA及蛋白的表達。 [結論]

4、:本實驗成功地進行了原代人包皮成纖維細胞和人卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)，細胞純度高，內(nèi)源性表達SMPD1基因，可作為細胞模型應用于進一步的siRNA篩選、鑒定及RNA干擾實驗。 第二部分siRNA的設計和篩選 [目的]:以人包皮成纖維細胞為模型，通過設計合成，實驗篩選，獲得高效、特異沉默SMPD1基因的siRNA，通過觀察siRNA對靶基因轉錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物沉默的量效和時效關系，系統(tǒng)了解sirNA在細胞內(nèi)的時空作用方式及代謝特征

5、，為進一步優(yōu)化實驗方案，獲得最佳的實驗結果提供實驗數(shù)據(jù)，為下一步細胞凋亡保護實驗奠定基礎。 [方法]: 1.針對SMPD1特異序列設計合成6對siRNA，另設隨機序列作為陰性對照(notargetsiRNA，NTsiRNA)。 2.用陽離子脂質體(Lipofectamine2000)作為轉染試劑，熒光標記的dsRNA低聚體(Fluorescentoligo)作為轉染效率的指示劑進行轉染條件的優(yōu)化和轉染效率的檢測。

6、不同濃度oligo(40nmol/L,60nmol/L,80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共轉染細胞，轉染后6h熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)，計算陽性細胞率。免疫熒光觀察轉染后細胞形態(tài)，流式細胞儀定量檢測轉染效率。 3.有效siRNA篩選：按照優(yōu)化的轉染條件，實驗組為siRNA1至sirNA6共6組，設立NTsiRNA對照，脂質體對照。siRNA濃度為50nmo

7、l/L，轉染48h后進行熒光定量RT-PCR檢測SMPD1mRNA水平變化，轉染72h后行WesternBlot檢測SMPD1蛋白水平的變化。 4.siRNA量效關系：用篩選出靶基因沉默效率最高的siRNA，以不同濃度siRNA(0.5、5、50、100nmol/L)轉染細胞，分別以NTsirNA、脂質體及Fluorescentoligo為對照，轉染后6h觀察熒光oligo的強度以確定轉染效率不低于80％，轉染后24h進行熒光定

8、量RT-PCR，以脂質體組為對照計算抑制率，繪制量效曲線。 5.siRNA時效關系：使用最佳siRNA的最佳濃度轉染細胞，分別以NTsiRNA、脂質體及Fluorescentoligo為對照，于轉染不同時間(12、24、48、72h)后收集細胞，進行熒光定量RT-PCR的檢測。以脂質體組為對照計算抑制率，繪制時效曲線。 6.siRNA對蛋白水平變化的時效關系：細胞轉染siRNA，轉染后不同時間點(24、48、72、96h

9、)進行細胞總蛋白提取，BCA法進行蛋白質定量。用蛋白印跡法進行SMPD1蛋白的檢測，β-actin作為內(nèi)參。 [結果]: 1.在人包皮成纖維細胞，lipofectamine20001.0μL可以達到最佳轉染效率，其值為98.3％。 2.在人包皮成纖維細胞中各條siRNA對SMPD1基因mRNA表達均有抑制作用，其中siRNA1的抑制率最佳，為96.29±4.58％。蛋白表達水平變化與mRNA一致。 3.s

10、iRNA濃度在0.5～50nmol/L之間目的基因的抑制率是逐漸上升的，當siRNA濃度達到100nmol/L時，抑制率下降，而陰性對照NT、siRNA的抑制率則上升。用50nmol/L濃度的siRNA轉染細胞，mRNA在48h后達到最大的抑制率，蛋白在轉染72h后達到最大的抑制率，96h恢復正常。β-actin各組無差異。 [結論]:在人包皮成纖維細胞達到最佳抑制效率的siRNA序列是siRNA1。靶向SMPD1的siRNA最

11、佳作用濃度為50nmol/L。SMPD1基因mRNA水平在48h達到最大抑制率，蛋白水平在72h達到最大抑制率，其后SMPD1表達逐漸恢復到轉染前水平。 第三部分靶向SMPD1的siRNA對顆粒細胞凋亡的保護作用 [目的]:通過觀察靶向SMPD1的siRNA對化療藥物絲裂霉素誘導的顆粒細胞凋亡的保護作用，從細胞水平上評估siRNA對女性生殖保護的潛能，為將來的動物整體實驗奠定基礎。 [方法]: 1.轉染條

12、件的優(yōu)化和轉染效率的檢測。不同濃度oligo(40nmol/L，60nmol/L，80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共轉染細胞，轉染后6h熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)，計算陽性細胞率。免疫熒光觀察轉染后細胞形態(tài)，流式細胞儀定量檢測轉染效率。 2.有效siRNA篩選：按照優(yōu)化的轉染條件，實驗組為sirNA1至sirNA6共6組，設立NTsiRNA對照，脂質體對照。

13、siRNA濃度為50nmol/L，轉染48h后進行熒光定量RT-PCR檢測SMPD1mRNA水平變化，轉染72h后行WesternBlot檢測SMPD1蛋白水平的變化。 3.絲裂霉素(MMC)致凋亡有效濃度的篩選：用不同濃度絲裂霉素干預細胞，24h后MTT法檢測細胞活力，篩選出有效的藥物濃度用于后續(xù)實驗。 4.siRNA對絲裂霉素誘導的顆粒細胞凋亡的抑制作用：細胞接種24h后轉染siRNA，轉染48h后給予絲裂霉素，藥物

14、干預24h后收集細胞，分別進行Hochest/PI雙染檢測細胞凋亡形態(tài)，MTT法檢測細胞活力，AnnexinV-PI雙染行流式細胞檢測細胞凋亡率。以同樣濃度的NTsiRNA，脂質體為對照。 [結果]: 1.在人卵巢顆粒細胞，lipofectamine20001.5μL可以達到最佳轉染效率，其值為61.6％。 2.在人卵巢顆粒細胞中只有siRNA3對SMPD1基因mRNA表達有抑制作用，抑制率為44.7±4.69％

15、。蛋白表達水平變化與mRNA一致。 3.MMC濃度在15μg/mL時人卵巢顆粒細胞凋亡率明顯增高，達到33.28％。 4.在阻斷了SMPD1基因的表達后，siRNA3組活細胞染色明顯增高，細胞存活率達到40.3％，與MMC組32.3％比較差異具有統(tǒng)計學意義。siRNA3組細胞凋亡率為44％，明顯低于MMC組的68.3％。 [結論]: 靶向SMPD1的siRNA能夠有效抑制絲裂霉素誘導的人卵巢顆粒細胞凋亡。