白介素--6對(duì)奶牛卵巢顆粒細(xì)胞排卵相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、排卵是雌性哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是由多因素參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。炎性細(xì)胞因子在卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)或活性的改變可導(dǎo)致卵巢周期延長(zhǎng)并發(fā)生排卵障礙。炎性細(xì)胞因子對(duì)顆粒細(xì)胞排卵相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是其發(fā)揮功能的主要途徑，但目前研究多集中于IL-1β和TNF-α。已有的報(bào)道表明，IL-6在排卵過(guò)程中所發(fā)揮的作用較其它細(xì)胞因子而言更為復(fù)雜，我們推測(cè)這與IL-6自身的生物學(xué)特性有關(guān)，并可能在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)的排卵過(guò)程中

2、起到關(guān)鍵作用。但是，目前對(duì)于IL-6在卵巢活動(dòng)周期，特別是在排卵過(guò)程中所發(fā)揮的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用研究較少。
　　本論文以體外原代培養(yǎng)的奶牛卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，采用RT-qPCR、westernblotting、 ELISA、ICC等方法，研究了IL-6對(duì)顆粒細(xì)胞排卵相關(guān)基因EGFR、VEGF、NOS、StAR和TIMPs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。研究結(jié)果顯示:(1)EGFR高表達(dá)于分離自大卵泡（直徑＞8mm）的顆粒細(xì)胞。給予外源性促

3、性腺激素刺激后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH較LH對(duì)EGFR mRNA表達(dá)的上調(diào)作用更為明顯。高濃度IL-6(10ng/ml)干預(yù)不僅能顯著下調(diào)顆粒細(xì)胞EGFRmRNA和蛋白表達(dá)，而且也可明顯抑制BTC誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白的磷酸化水平。IL-6對(duì)EGFR表達(dá)的抑制作用主要通過(guò)激活ERK1/2與PI3K/AKT信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)，此效應(yīng)可以被ERK1/2與AKT抑制劑所逆轉(zhuǎn)。本部分研究表明，IL-6對(duì)顆粒細(xì)胞EGFR的調(diào)節(jié)作用具有多重性，可以分別在mRNA轉(zhuǎn)錄

4、、蛋白翻譯及生物學(xué)活性等水平抑制EGFR的表達(dá)及功能。這一抑制作用經(jīng)ERK1/2和PI3K/AKT途徑介導(dǎo)。(2)高濃度IL-6可以顯著上調(diào)FSH誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞VEGF基因及蛋白表達(dá)。此外，也可明顯促進(jìn)VEGF上游調(diào)節(jié)因子HIF-1α和COX2mRNA的表達(dá)。在特異性阻斷HIF-1α和COX2后，VEGF基因及蛋白表達(dá)水平顯著降低。IL-6可以通過(guò)活化JAK/STAT3信號(hào)途徑上調(diào)顆粒細(xì)胞VEGF的表達(dá)，這種上調(diào)作用可以被JAK抑制劑所

5、削弱。本部分研究表明，IL-6可以通過(guò)提高HIF-1α和COX2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)顆粒細(xì)胞VEGF的合成，這種促進(jìn)作用與JAK/STAT3信號(hào)途徑活化有關(guān)。(3) IL-6及其受體IL-6Rα高表達(dá)于分離自大卵泡的顆粒細(xì)胞。高濃度IL-6可明顯下調(diào)顆粒細(xì)胞StAR表達(dá)及孕激素合成，而對(duì)P450scc和3β-HSD表達(dá)的影響不顯著。IL-6通過(guò)活化ERK1/2信號(hào)途徑下調(diào)StAR表達(dá)，使用ERK1/2抑制劑可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。本部分研究表明，I

6、L-6可能通過(guò)下調(diào)StAR的表達(dá)以抑制孕激素合成。ERK1/2信號(hào)途徑參與IL-6對(duì)顆粒細(xì)胞StAR表達(dá)的調(diào)節(jié)過(guò)程。(4)高濃度IL-6可以顯著上調(diào)顆粒細(xì)胞iNOS表達(dá)及NO合成，而對(duì)eNOS的表達(dá)無(wú)明顯影響。特異性阻斷iNOS后，NO合成水平顯著降低。IL-6可以通過(guò)活化JAK/STAT3途徑上調(diào)iNOS表達(dá)，使用JAK抑制劑可削弱這種上調(diào)作用。本部分研究表明，IL-6可以通過(guò)上調(diào)iNOS基因與蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)顆粒細(xì)胞NO的合成。JAK

7、/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)這一生物學(xué)效應(yīng)。(5)高濃度隱丹參酮(10μM)可以顯著下調(diào)IL-6誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞TIMP2表達(dá)。在隱丹參酮干預(yù)后的5、15及30min，IL-6誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞ERK1/2和STAT3蛋白磷酸化被顯著削弱。此外，隱丹參酮也可以下調(diào)STAT3通路上游蛋白JAK2的活化水平。隱丹參酮主要通過(guò)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路活化而下調(diào)TIMP2的表達(dá)，使用JAK/STAT3抑制劑可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。本部分研究表明，隱

8、丹參酮主要通過(guò)抑制IL-6受體信號(hào)途徑下游蛋白的磷酸化而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。JAK/STAT3信號(hào)途徑參與隱丹參酮抑制IL-6所誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞TIMP2表達(dá)過(guò)程。這不僅可以在分子水平闡明其在治療排卵障礙性疾病中的作用機(jī)制，而且也進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-6在調(diào)節(jié)排卵過(guò)程中的重要作用。
　　總之，本研究從不同層次及角度揭示了存在于卵泡局部的重要炎性細(xì)胞因子——IL-6在調(diào)控排卵過(guò)程中的部分生物學(xué)功能，這不僅有利于深入理解卵巢周期性活動(dòng)的內(nèi)在機(jī)制，