SUMo-1在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞的正常生命活動涉及到各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式的調(diào)控，這些修飾能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能及細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)。雖然這并不改變蛋白質(zhì)合成和降解的速度，但可能影響蛋白質(zhì)的功能，因此增加了蛋白質(zhì)功能研究的復(fù)雜性。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式和形式有很多種。SUMO（小泛素相關(guān)修飾物）是一類結(jié)構(gòu)與泛素類似的小分子修飾物(Ubls)。目前，在哺乳動物中已存在SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3和SUMO-4四種SUMO分子。SUMO-1則是一種分子量約12

2、 KDa，在真核生物中廣泛存在SUMO分子。通過E1、E2以及E3酶的催化作用，與底物蛋白相結(jié)合而起作用。這一特異性的結(jié)合過程叫做SUMO化(SUMOylation)。SUMO化作為一種動態(tài)可逆的蛋白翻譯后修飾方式之一，能被SUMO特異性蛋白酶(SENP)所逆轉(zhuǎn)，這一動態(tài)平衡參與調(diào)控真核細(xì)胞多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖和分化、兩種或多種蛋白質(zhì)之間的相互作用，信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)靶蛋白分子的細(xì)胞定位/轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性和生

3、物學(xué)活性等等。在哺乳動物中，增殖和分化的卵巢顆粒細(xì)胞對卵泡發(fā)育以及卵子發(fā)生過程起重要調(diào)控作用。目前，關(guān)于SUMO-1在顆粒細(xì)胞中的作用和功能還不是很明確。
　　因此本研究的主要目的是通過研究SUMO-1、UBC9在卵巢中的定位和表達(dá)模式，探討其在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用，揭示SUMO-1及UBC9對卵巢顆粒細(xì)胞周期、增殖和凋亡過程的調(diào)節(jié)作用，同時鑒定未知的SUMO-1靶蛋白及對細(xì)胞調(diào)控的研究，為進(jìn)一步理解卵巢多種生理生化過程的調(diào)節(jié)機(jī)制

4、提供重要的理論依據(jù)。
　　本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，PMSG/hCG注射小鼠，不同時間段取小鼠卵巢樣本，應(yīng)用Western blotting和免疫組化方法檢測SUMO-1和UBC9在不同發(fā)育階段的卵泡中的表達(dá)和定位模式。另外，用PCR方法構(gòu)建pCMV-N-HA/Flag-SUMO1/UBC9，pCMV-N-Flag-SUMO1G96-97A, pEGFP-C1-SUMO1/UBC9, pCMV-N-HA-PTX3以及pCMV-N-H

5、A-PTX3 K203R8種真核表達(dá)載體。體外培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞作為研究對象，將各種過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過免疫細(xì)胞化學(xué)法，檢測SUMO-1/UBC9/PTX3蛋白在細(xì)胞中的分布和定位。用流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀檢測SUMO-1及UBC9在卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等過程中的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，揭示其參與的特定過程。同時，通過免疫印跡和免疫共沉淀的方法驗(yàn)證PTX3是否能被SUMO-1修飾以及鑒定出被修飾的主要位點(diǎn)。這

6、些初步的研究，為后續(xù)研究SUMO-1蛋白的修飾作用打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果如下:
　　(1)成功構(gòu)建pCMV-N-HA/Flag-SUMO1/UBC9，pCMV-N-Flag-SUMO1G96-97A，pEGFP-C1-SUMO1/UBC9，pCMV-N-HA-PTX3以及pCMV-N-HA-PTX3K203R真核表達(dá)載體;
　　(2) Western blotting實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)源性的SUMO-1、UBC9在

7、不同發(fā)育時期的小鼠卵巢組織中，在34，43和72 KDa有高分子量的復(fù)合物蛋白的表達(dá)，表達(dá)模式也不同。PMSG處理后，SUMO-1在34/43 KDa處，1h時顯著升高，12/24 h時最低，36h后又升高?！?2 KDa處和總蛋白，在12/24/36 h時降低，48 h后增加。hCG處理后，34/43 KDa處，9/11 h時表達(dá)增加，7/15 h時較低。72 KDa處變化不明顯?？偟鞍?1h和24 h時有所上升。同時，PMSG處理后

8、，UBC9在34/43 KDa處24/36/48 h時表達(dá)量升高，總蛋白48 h最高。hCG處理后，11h最低?？偟鞍撞町惒淮?。說明SUMO-1、UBC9的特異性表達(dá)受生殖激素調(diào)控，可能同卵泡生長發(fā)育相關(guān)，并且可能參與調(diào)控卵泡發(fā)育，卵母細(xì)胞成熟和顆粒細(xì)胞發(fā)育的生理過程;同時，體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞也表現(xiàn)出不同的SUMO-1、UBC9表達(dá)模式，48 h時的表達(dá)量明顯較高;
　　(3)免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，在8，10天的小鼠初級和次級卵泡

9、中發(fā)現(xiàn)SUMO-1、UBC9很強(qiáng)的陽性信號，主要分布在卵母細(xì)胞核和顆粒細(xì)胞中，PMSG處理后在各個時期的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有信號，差異不明顯。然而，在12h的時候很強(qiáng)。hCG處理后主要定位在有腔卵泡和排卵前卵泡中，同時在黃體細(xì)胞中也能觀察到陽性信號;
　　(4)將SUMO-1、UBC9過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染至小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，間接免疫熒光結(jié)果表明，SUMO-1和UBC9蛋白在顆粒細(xì)胞核中存在特異性表達(dá)和定位，當(dāng)SUMO-1的G96

10、-97兩個活性氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變后，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都能檢測到定位，這些結(jié)果說明G96-97A能影響SUMO-1在顆粒細(xì)胞中的定位，SUMO-1可能在細(xì)胞核中發(fā)生重要的作用;
　　(5)檢測到SUMO-1、UBC9的過表達(dá)和突變對顆粒細(xì)胞周期、凋亡以及增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SUMO-1、UBC9細(xì)胞周期的S期略有降低，但是差異不顯著，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，SUMO-1和UBC9在一定程度上能促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，過表達(dá)SUMO-1、U

11、BC9后顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，G96-97突變后，細(xì)胞凋亡更加明顯，這說明SUMO-1和SUMO化能介導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡;
　　(6)免疫印跡和免疫共沉淀分析表明，PTX3能被SUMO-1修飾，同時鑒定lys203是其SUMO化修飾位點(diǎn)。當(dāng)lys203位點(diǎn)發(fā)生突變時，顯著降低了PTX3的SUMO-1修飾程度，表明lys203是關(guān)鍵的SUMO-1修飾位點(diǎn)。研究表明，內(nèi)源的PTX3主要定位在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，過表達(dá)的PTX3定位在胞

12、質(zhì)和胞核中，然而，K203R突變后，僅僅定位在細(xì)胞核中，我們推測，lys203是PTX3被SUMO-1修飾后，使其在細(xì)胞質(zhì)中定位的關(guān)鍵點(diǎn)，可能涉及到PTX3從細(xì)胞質(zhì)分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的過程，對卵丘細(xì)胞外基質(zhì)的形成有重要的作用。
　　本研究主要證實(shí)了，SUMO-1及UBC9在不同發(fā)育時期小鼠卵巢組織中具有特異性的時間和空間表達(dá)模式，其表達(dá)水平受生殖激素的調(diào)控，且呈時間依賴性趨勢;SUMO-1、UBC9在不同發(fā)育時期的卵泡、顆粒細(xì)胞以及