miR-133b對人卵丘顆粒細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　我國不孕癥發(fā)病率7％～10%，并有逐年上升的趨勢。在不孕癥的諸多病因中，卵泡發(fā)育和成熟障礙是女性不孕癥常見的類型，卵丘顆粒細胞是成熟卵泡中最大的細胞群。研究miR-133b在卵丘顆粒細胞中的表達及其作用機制，對于探明調控卵泡發(fā)育成熟分子機制，尋找影響卵泡生長發(fā)育新的藥物靶點，為防治女性不孕癥及相關的內分泌疾病提供理論依據。
　　方法:
　　收集2015年05月至2015年09月在廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院生殖

2、中心進行卵胞漿內單精子顯微注射（ICSI）治療的女性不孕患者的卵丘顆粒細胞進行體外培養(yǎng)。
　?。?）光學顯微鏡和CCK-8法觀察人卵丘顆粒細胞體外培養(yǎng)過程中的生長情況。
　?。?）Real-time PCR技術檢測人卵丘顆粒細胞體外培養(yǎng)過程中 miR-133b、cleaved caspase3及TAGLN2的表達。
　?。?）將miR-133b轉染至人卵丘顆粒細胞中，采用CCK-8法、流式細胞儀技術和Western b

3、lot技術檢測miR-133b對人卵丘顆粒細胞增殖、凋亡及周期的影響。
　?。?）將miR-133b轉染至人卵丘顆粒細胞中，采用Western blot和Real-time PCR技術檢測miR-133b對人卵丘顆粒細胞中TAGLN2表達水平的影響。
　　結果:
　?。?）光學顯微鏡和CCK-8顯示，人卵丘顆粒細胞體外培養(yǎng)4～6h后細胞開始貼壁，24h貼壁率達96%，第2～3天增殖迅速，細胞間以絲狀突起相互連接，第4天

4、后細胞逐漸退化凋亡。
　　（2） Real-time PCR顯示人卵丘顆粒細胞體外培養(yǎng)過程中，第2～4天miR-133b的mRNA水平逐漸升高（P?0.01），而cleaved caspase3和TAGLN2的mRNA水平逐漸降低（P?0.01）；第4天后miR-133b的mRNA水平不斷降低（P?0.01），則cleaved caspase3的mRNA水平不斷升高（P?0.05）， TAGLN2的mRNA水平于第6天后也不斷升高

5、（P?0.01）。
　?。?）按0nM、50nM、100 nM濃度和24h、48h、72h、96h時間梯度將miR-133b mimic、inhibitor及對應的陰性對照轉染至人卵丘顆粒細胞中。CCK-8顯示， miR-133b mimic轉染24h、48、72h后，顆粒細胞數顯著增多（P?0.05）；而miR-133b inhibitor抑制人卵丘顆粒細胞的增殖（P?0.05）。流式細胞儀顯示，與對照組相比，miR-133b

6、mimic促使G0/G1期細胞進入S和G2期，細胞凋亡率顯著降低（P?0.05）；miR-133b inhibitor使細胞阻滯于G0/G1期，但細胞凋亡結果無顯著差異。Western blot顯示miR-133b mimic顯著下調cleaved caspase3蛋白質水平（P?0.01），上調pro-caspase3蛋白質水平，但差異無統(tǒng)計學意義（P?0.05）；miR-133b inhibitor顯著上調 cleaved casp

7、ase3蛋白質水平（P?0.05），顯著下調pro-caspase3蛋白質水平（P?0.01）。
　?。?）Real-time PCR和Western blot顯示在人卵丘顆粒細胞中， miR-133b mimic在mRNA和蛋白質水平可顯著下調TAGLN2的表達（P<0.05）；miR-133b inhibitor在mRNA和蛋白質水平可顯著上調TAGLN2的表達（P<0.05）。
　　結論:
　　1、人卵丘顆粒細胞