miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞調控的研究.pdf

1、miRNA廣泛在哺乳動物卵巢中表達，對卵泡的生長發(fā)育和卵巢的功能具有關鍵調控作用。眾多研究表明，miR-101與miR-144調控多種細胞的生長、分化和凋亡。但是目前尚未有miR-101與miR-144調控奶山羊卵巢顆粒細胞的研究。本研究以關中奶山羊為研究對象，采用生物信息學預測和雙熒光素酶報告載體構建等方法驗證miR-101與miR-144的靶基因;采用RT-qPCR、Western blot檢測技術研究miR-101與miR-144

2、對靶基因TGIF1的調控作用;采用流式細胞術等方法研究miR-101與miR-144對卵巢顆粒細胞凋亡的調控作用機制;以期闡明miR-101與miR-144調控卵巢顆粒細胞的作用機制，為提高奶山羊產羔率提供試驗依據。主要研究結果如下:
　　1、在奶山羊卵巢顆粒細胞中，驗證miR-101、miR-144與TGIF1基因的靶向調節(jié)關系
　　(1)利用生物信息學軟件預測了TGIF1基因3'UTR區(qū)含有miR-101和miR-144

3、的靶位點。構建雙熒光素酶報告載體，分別將miR-101和miR-144的模擬物以及Negativecontrol(NC)與TGIF1-3'UTR區(qū)雙熒光素酶報告載體共轉染到293T細胞中，檢測熒光素酶活性。結果表明，與NC組相比，miR-101和miR-144分別顯著抑制熒光素酶活性。而將NC、miR-101和miR-144的模擬物與突變載體共轉染，檢測熒光素酶活性。結果顯示，與NC組相比，miR-101和miR-144對突變載體的熒光

4、素酶活性沒有顯著影響。據此初步鑒定TGIF1基因為miR-101和miR-144的靶基因。
　　(2)采用RT-qPCR和Western blot技術檢測miR-101和miR-144對靶基因TGIF1的表達調控，同時檢測TGIF1基因在山羊組織中的表達情況。分別將NC、miR-101和miR-144的模擬物以及抑制劑轉染至奶山羊卵巢顆粒細胞中，結果顯示，與NC組相比，miR-101和miR-144分別顯著下調靶基因TGIF1在m

5、RNA和蛋白水平上的表達;而轉染miR-101和miR-144的抑制劑之后，顯著上調TGIF1基因在mRNA和蛋白水平上的表達。同時根據RT-qPCR的檢測結果，顯示在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中，TGIF1基因的表達相對較高。
　　2、研究miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡的調控作用機制
　　(1)采用流式細胞術檢測miR-101與miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡的影響，結果表明，與NC組相比，過表

6、達miR-101與miR-144使顆粒細胞的凋亡率顯著升高。
　　(2)采用Western blot技術檢測Bcl-2、Bax和p53等凋亡基因的蛋白表達，結果表明，與NC組相比，miR-101和miR-144顯著下調Bcl-2和Bax凋亡基因的蛋白表達，顯著降低Bcl-2/Bax的蛋白比值;與NC組相比，miR-101和miR-144顯著上調p53磷酸化水平。
　　以上結果表明，TGIF1基因在奶山羊的子宮、卵巢和乳腺中的