CDC25C基因在成年山羊與幼年山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及功能驗證.pdf

1、卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡的一種重要組成單位，環(huán)繞于卵母細(xì)胞周圍。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡顆粒細(xì)胞會發(fā)生相應(yīng)的變化，其增殖分泌的多種激素及生長因子與卵母細(xì)胞的生長和成熟有著極為重要的作用。
　　本研究前期發(fā)現(xiàn)，幼齡母羊與成年母羊的卵母細(xì)胞在體外成熟過程中，成熟率有著顯著性差異，并且幼齡母羊的卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟受精后發(fā)育至四細(xì)胞的比例也顯著性低于成年母羊。試驗中發(fā)現(xiàn)，幼齡母羊與成年母羊的卵泡顆粒細(xì)胞有著很大的不同點，無論是數(shù)量，還是環(huán)繞卵母細(xì)胞

2、的形態(tài)。
　　另一個發(fā)現(xiàn)就是細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C基因在幼齡母羊卵母細(xì)胞與成年母羊卵母細(xì)胞中的表達(dá)有顯著性差異，這個基因具有調(diào)控細(xì)胞分裂周期作用，可調(diào)節(jié)真核生物細(xì)胞有絲分裂，是細(xì)胞周期進(jìn)入M期的關(guān)鍵因子之一。
　　綜合上述兩種發(fā)現(xiàn)，本實驗決定從卵泡顆粒細(xì)胞的角度驗證CDC25C基因功能，嘗試解開不同年齡階段卵母細(xì)胞成熟率差異的原因。本實驗以江蘇南通當(dāng)?shù)匕咨窖驗檠芯繉ο?，采?.5年齡以上的成年母羊與2月齡羔羊的卵巢并

3、使用0.01M PBS帶回實驗室。體外分離卵泡顆粒細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后，對成年母羊與羔羊的卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行了CDC25C、CDK1、WEE1相關(guān)基因，雌激素和孕激素，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期等相關(guān)檢測，結(jié)果如下:
　　1.山羊CDC25C基因的克隆
　　根據(jù)NCBI提供的CDC25C基因序列，設(shè)計引物克隆CDC25C基因的CDS區(qū)，隨后構(gòu)建該基因的pCMV-HA-CDC25C載體和小分子干擾載體siCDC25C。測序結(jié)果表明pCMV-HA

4、-CDC25C載體構(gòu)建正確，與此同時小分子干擾載體siCDC25C在預(yù)實驗中被證實有效，皆可用于后續(xù)試驗。
　　2.原代分離細(xì)胞的鑒定
　　依據(jù)酶聯(lián)免疫原理，山羊卵泡顆粒細(xì)胞表面擁有特異性FSH受體，試驗采用RabbitAnti-FSHR多克隆抗體作為一抗，SA1074-兔IgG為二抗，經(jīng)過酶聯(lián)免疫檢測后認(rèn)定，本實驗分離的細(xì)胞絕大部分都是所需要的卵泡顆粒細(xì)胞，可繼續(xù)后續(xù)試驗。
　　3.CDC25C基因?qū)β雅蓊w粒細(xì)胞的影

5、響
　　構(gòu)建pCMV-HA-CDC25C載體和小分子干擾載體siCDC25C，轉(zhuǎn)染成年山羊和幼齡山羊卵泡顆粒細(xì)胞后，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，利用酶聯(lián)免疫方式檢測了PROG和E2兩種激素分泌情況，利用切片技術(shù)比較了成年山羊與幼齡山羊卵巢的區(qū)別，利用細(xì)胞周期檢測技術(shù)比較了兩種山羊卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組載體和干擾載體后的細(xì)胞周期區(qū)別。
　　(1)轉(zhuǎn)染pCMV-HA-CDC

6、25C載體后，成年山羊的卵泡顆粒細(xì)胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達(dá)量都得到了顯著性提升;PROG和E2兩種激素的分泌量也有所上升，且與空白組比較差異顯著;成年山羊卵巢上的卵泡較少，但發(fā)育程度更好;細(xì)胞中分裂期占間期的比例得到顯著性上升。轉(zhuǎn)染pCMV-HA-CDC25C載體后，幼齡山羊的卵泡顆粒細(xì)胞的CDC25C基因的相對表達(dá)量得到上升，但是CDK1、WEE1基因的相對表達(dá)量卻出現(xiàn)了下降;PROG和E2兩種激素的分泌量也

7、有所上升;幼齡山羊卵巢上的卵泡更多，但發(fā)育程度不好;細(xì)胞中分裂期占間期的比例得到顯著性上升。
　　(2)轉(zhuǎn)染小分子干擾載體siCDC25C后，成年山羊的卵泡顆粒細(xì)胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達(dá)量都有所下降;PROG和E2兩種激素的分泌量有一定上升;細(xì)胞中分裂期占間期的比例有顯著性下降。幼齡山羊的卵泡顆粒細(xì)胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達(dá)量均有所下降;PROG和E2兩種激素的分泌量有一定上升;細(xì)