CAEV p28蛋白的原核表達及CAEV感染山羊卵巢顆粒細胞的研究.pdf

1、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎(CaprineArthritisEncephalitis,CAE)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CaprineArthritisEncephalitisVirus,CAEV)引起的山羊的慢性傳染病。CAE的典型癥狀是山羊羔腦脊髓炎和成年山羊多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、硬結(jié)性乳房炎以及間質(zhì)性肺炎。該病呈全球分布，英國、美國等發(fā)達國家更為嚴重，我國于1982年進口種山羊時傳入本病，該病對山羊種群造成的經(jīng)濟損失是慘重的。但

2、是目前，對該病的預防與控制仍是世界各國所面臨的難題。為了在我國更好地預防和控制本病的發(fā)生和流行，建立一種快速、簡單、可靠的檢測CAEV的診斷方法，本試驗在大腸桿菌中誘導表達了CAEVp28特異性蛋白，并用該蛋白作抗原建立了間接ELISA檢測方法，用該方法對100份本室保存血清進行了檢測?！　∈紫仁褂蒙窖蜿P(guān)節(jié)滑膜細胞成功繁殖了山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒后，參照GenBank發(fā)表的基因序列，設計合成一對帶有酶切位點的引物，對CAEV甘肅株p28

3、基因進行PCR擴增，并進行了分子克隆，利用pET表達載體成功實現(xiàn)了p28基因在大腸桿菌中的表達。重組蛋白氨基端帶有6個組氨酸標簽，利用固定化金屬離子親和層析法進行純化，免疫印跡試驗證明該重組蛋白具有良好的抗原性和特異性。以純化蛋白作為診斷抗原建立了間接ELISA診斷方法，確定其最佳工作條件為重組抗原每孔包被0.1μg，陽性血清以1：50倍稀釋，辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG(HRP-兔抗山羊IgG)以1：1000倍稀釋，HRP-兔抗山

4、羊IgG最佳作用時間為2h，判定標準為P/N值大于2，且OD值在1.0左右的血清為陽性，否則判為陰性；同時用純化的p28蛋白免疫小鼠，制備陽性血清。利用重組蛋白抗原檢測3只CAEV攻毒后山羊血清抗體水平時發(fā)現(xiàn)，3只山羊均在接種2周后可產(chǎn)生p28蛋白的相應抗體，此抗體一直持續(xù)存在且滴度較高。在分別以p28蛋白做抗原的瓊脂糖免疫擴散試驗(AGID)結(jié)果和間接ELISA試驗結(jié)果對比中發(fā)現(xiàn)，攻毒山羊在接種5周后用兩種方法都可檢測到血清抗體，但瓊

5、擴方法檢測到抗體的最早時間比ELISA方法檢測到抗體的最早時間要遲3周，而且瓊擴方法在檢測攻毒后第6個月山羊血清時為陰性，而ELISA方法檢測結(jié)果為陽性，一方面說明表達的p28蛋白抗原性好，另一方面也說明用瓊擴方法能夠檢測到的p28抗體水平要比ELISA方法能夠檢測到的p28抗體水平高，ELISA診斷方法比瓊擴診斷方法有高的敏感性。重組抗原在實際應用中共檢測100份血清樣品，67份抗體檢測呈陽性?！　∥覀冎繡AEV能夠在山羊關(guān)節(jié)滑膜

6、、胎肺、眼角膜細胞上繁殖，但最近國外有報道稱：CAEV在山羊卵巢顆粒細胞上也能夠繁殖，而且山羊卵巢顆粒細胞經(jīng)常被用于體外卵母細胞成熟，同時幾乎所有的工業(yè)化國家山羊種群都高度感染CAEV，而且許多不明來源的卵母細胞被用作體外山羊胚胎生產(chǎn)，所以我們認為作為飼養(yǎng)層細胞的顆粒細胞可能是山羊胚胎感染CAEV的主要來源，因此，顆粒細胞能否被CAEV感染是我們確定山羊胚胎感染CAEV的途徑提供一條新的線索。為此，本研究進行了CAEV在山羊卵巢顆粒細胞

7、上的感染性試驗。對山羊卵巢顆粒細胞進行原代培養(yǎng)，傳代2-3代以后，接種CAEV，觀察細胞病變，提取病變細胞核酸后，用設計好的的針對CAEVp28基因的引物進行PCR擴增，擴增出一條660bp的片段，經(jīng)過序列分析后，確定為p28基因，證明CAEV基因組已整合到顆粒細胞基因組上；用上面試驗中制備的p28蛋白免疫小鼠獲得的陽性血清對病毒在顆粒細胞上的培養(yǎng)物進行CAEV特異性蛋白的免疫印跡試驗，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物中有CAEV特異性p28蛋白，證實整合到

8、顆粒細胞基因組上的CAEV能表達CAEV特異性蛋白；又用顆粒細胞上繁殖的CAEV在山羊關(guān)節(jié)滑膜細胞進行病毒滴定，結(jié)果TCID50值為10-5/ml,顯示CAEV在山羊顆粒細胞上能夠繁殖，并釋放出病毒粒子?！　”驹囼炘趪鴥?nèi)首次成功表達了CAEVp28基因并建立了針對該蛋白的間接ELISA的診斷方法。該診斷方法敏感、特異，為我國CAEV的診斷與監(jiān)測提供了一種技術(shù)手段，并為該診斷試劑盒的研制與開發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。同時確定了起源于山羊卵泡的顆