高繁殖力黃淮山羊類(lèi)固醇激素分泌特點(diǎn)與卵泡顆粒細(xì)胞基因差異表達(dá)的研究.pdf

1、本文調(diào)查了黃準(zhǔn)山羊高繁殖力母羊不同胎次與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，比較了高低繁殖力母羊在發(fā)情周期和卵巢摘除初期外周血P4和E2變化的特點(diǎn)，探討了不同繁殖性狀母羊在黃體期早期的卵泡、黃體及其卵泡閉鎖的差異。通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)建立起了高繁殖力母羊卵泡發(fā)育顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cDNA文庫(kù)，旨在揭示高繁殖力母羊卵泡發(fā)育調(diào)控及生殖內(nèi)分泌特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究高繁殖力母羊的遺傳育種提供一定的參考依據(jù)。
　　 1黃淮山羊高繁殖力母羊產(chǎn)羔調(diào)查與分析<

2、br>　　 為了探究高繁殖力母羊多胎繁殖性狀的特點(diǎn)，對(duì)江淮地區(qū)427只具有高繁殖力黃淮山羊母羊（窩產(chǎn)羔數(shù)至少一次產(chǎn)羔≧5）的產(chǎn)羔進(jìn)行了調(diào)查和分析。結(jié)果表明，隨著胎次的增加，高繁殖力母羊的產(chǎn)羔數(shù)增加，直至第5胎次，之后產(chǎn)羔數(shù)下降。在所有胎次中，高繁殖力母羊在第5胎次的產(chǎn)羔數(shù)達(dá)到最大，平均窩產(chǎn)羔數(shù)3.78-0.06羔，與其他胎次的產(chǎn)羔數(shù)相比較，呈極顯著差異；相比之下，母羊在第1胎次的產(chǎn)羔數(shù)極顯著低于其他胎次。根據(jù)不同窩產(chǎn)羔數(shù)的母羊所占比例

3、分析，在第1胎次，隨窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，其母羊的比例依次降低，但在之后母羊所占的比例中，窩產(chǎn)l羔和2羔的比例急劇下降；而窩產(chǎn)4～7羔的母羊比例呈遞增趨勢(shì)延至第4～5胎次，其中隨著窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，其母羊所占比例的最大值在不同胎次間的分布依次后移。以上結(jié)果提示，高繁殖力母羊的多胎性狀在不同胎次間具有明顯的差異，其母羊性成熟后在初次繁殖時(shí)卵巢卵泡成熟與排卵及其妊振生理等已經(jīng)具備了極端高繁殖力的生理特點(diǎn)。
　　 2在發(fā)情周期中高低繁殖力母羊

4、外周血孕酮和雌二醇濃度變化的比較選擇生殖機(jī)能正常、空懷、經(jīng)產(chǎn)的黃淮山羊高繁殖力(窩產(chǎn)羔數(shù)至少一次產(chǎn)羔≧5)和低繁殖力（每次窩產(chǎn)羔數(shù)≦2）母羊各4只。以間隔12d肌注氯前列烯醇0.1mg/只·次誘導(dǎo)同期發(fā)情后，在自然發(fā)情周期中，連續(xù)兩個(gè)情期每天以間隔12h和在黃體中期和發(fā)情前期間隔12min密集性采集頸靜脈瘺管血樣，測(cè)定外周血E2和P4含量。結(jié)果顯示，在黃體期的大多數(shù)時(shí)間內(nèi)，高繁殖力母羊外周血P4量高于低繁殖力母羊，在黃體期早期的P4量上

5、升速度，高繁殖力羊早于低繁殖力羊；兩組母羊在P4的平臺(tái)期，P4量呈顯著性差異。在整個(gè)發(fā)情周期中，高繁殖力母羊平均E2濃度均高于低繁殖力母羊；在黃體期早期，高繁殖力母羊出現(xiàn)2個(gè)E2峰值，而低繁殖力母羊僅有1個(gè)。高低繁殖力母羊外周血P4和E2的量均是以非典型的脈沖式變化。以上結(jié)果表明，在黃體期早期，高繁殖力母羊外周血P4量的上升速度和卵泡波卵泡發(fā)育的周轉(zhuǎn)均高于低繁殖力母羊，而在E2含量上，高繁殖力母羊維持在較高水平。
　　 3高低繁

6、殖力母羊在黃體期早期卵巢卵泡和黃體的比較
　　 高低繁殖力母羊各4只，在氯前列烯醇同期發(fā)情后的第3個(gè)發(fā)情周期7～9d，通過(guò)頸靜脈瘺管采集羊的外周血液，測(cè)定E2和P4含量，并于第7和第9d應(yīng)用羊用腹腔內(nèi)窺鏡和腹部手術(shù)方法，觀察和測(cè)定母羊卵泡和黃體大小。結(jié)果顯示，在發(fā)情周期7～9d的卵泡發(fā)育中，高低繁殖力母羊卵巢小卵泡和大卵泡數(shù)均處于減少趨勢(shì)中，但差異均不顯著，而中卵泡數(shù)以及總卵泡數(shù)均增加，其中高繁殖力母羊的中卵泡數(shù)平均增加了7.5

7、0個(gè)/只，低繁殖力母羊平均增加了4.80個(gè)/只。高繁殖力母羊外周血P4和E2濃度分別高于低繁殖力母羊，P4濃度在高低繁殖力母羊之間呈顯著性差異；在發(fā)情周期第9d，高繁殖力母羊卵巢小卵泡數(shù)和Ⅱ型黃體數(shù)均分別顯著高于低繁殖力羊16.43％和27.73％。以上結(jié)果表明，在發(fā)情周期7～9d的卵泡發(fā)育中，黃淮山羊高低繁殖力母羊卵巢小卵泡、中卵泡和大卵泡數(shù)的發(fā)育趨勢(shì)基本處于相同的生理變化。高繁殖力母羊外周血P4濃度顯著高于低繁殖力母羊，促進(jìn)了高繁殖

8、力母羊卵泡的周轉(zhuǎn)；高繁殖力母羊排卵卵泡以體積相對(duì)較小的成熟卵泡增多，卵巢卵泡的共優(yōu)勢(shì)化明顯，Ⅱ型黃體數(shù)增加。
　　 4卵巢摘除初期高低繁殖力母羊外周血孕酮和雌二醇濃度變化的比較
　　 高低繁殖力母羊各4只，在發(fā)情周期的第9d，通過(guò)腹部外科手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢，并應(yīng)用頸靜脈瘺管連續(xù)5d和卵巢摘除后第1和第5d密集性采血。結(jié)果顯示，母羊卵巢在摘除后的E2和P4分泌，均以非典型性的脈沖式釋放。在卵巢摘除后的第ld，高繁殖力母羊外周

9、血液P4和E2濃度均分別大于低繁殖力母羊。高低繁殖力母羊在卵巢去除后的1～3d的P4水平均呈下降趨勢(shì)；高繁殖力母羊的E2除在第ld極顯著性高于低繁殖力羊外，在其后的2～5d，E2的平均值總體呈低于低繁殖力母羊的趨勢(shì)，并在第5d呈現(xiàn)差著性差異。以上結(jié)果表明，母羊非性腺相關(guān)組織在分泌E2和P4時(shí)呈現(xiàn)非典型的脈沖式。在外周血E2量上，高低繁殖力母羊之間存在呈現(xiàn)顯著性差異，非性腺組織所產(chǎn)生的E2可能參與了母羊的生殖過(guò)程。
　　 5山羊黃

10、體期閉鎖卵泡的組織定位觀察
　　 高低繁殖力母羊各4只，在發(fā)情周期第9d通過(guò)腹部外科手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢，迅即投入液氮中保存，冷凍切片，TUNEL檢測(cè)法結(jié)合蘇木精染色法，觀察卵巢閉鎖卵泡的組織學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果顯示，在高低繁殖力母羊卵巢閉鎖的無(wú)腔卵泡中，均極少見(jiàn)到凋亡的卵母細(xì)胞。有腔卵泡的閉鎖，多表現(xiàn)在卵泡腔的壁顆粒細(xì)胞層中有大量顆粒細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出明顯的熒光反應(yīng)，并多處于近腔顆粒細(xì)胞；而部分卵泡在顆粒層中出現(xiàn)凋亡細(xì)胞偶有零星存在的現(xiàn)象，

11、但是在高低繁殖力母羊之間均無(wú)明顯差異。在高繁殖力母羊的卵巢中，僅一膜之隔的相鄰卵泡之間閉鎖和非閉鎖同時(shí)顯現(xiàn)。以上結(jié)果表明，TUNEL檢測(cè)結(jié)合原片蘇木精染色的鑒定為卵巢組織凋亡細(xì)胞的定位提供一個(gè)較好的方法。在閉鎖的有腔卵泡中，卵泡多表現(xiàn)出近腔細(xì)胞的凋亡特征，高低繁殖力母羊在閉鎖卵泡的組織定位上無(wú)顯著性差異。
　　 6高繁殖力母羊大小卵泡顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選
　　 以氯前列烯醇肌肉注射2只高繁殖力

12、母羊40h后剪取卵巢，在20min內(nèi)計(jì)數(shù)卵泡、測(cè)量卵泡直徑，以組織鈍性分離和收集顆粒細(xì)胞，并剪取取樣后的卵泡部分組織置入液氮內(nèi)保存。從顆粒細(xì)胞中提取總RNA的大卵泡(5～6 mm)和小卵泡(3～4 mm)均未發(fā)生凋亡，總RNA經(jīng)過(guò)雙鏈cDNA的合成和擴(kuò)增，以抑制消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了山羊卵泡顆粒細(xì)胞正向和反向cDNA文庫(kù)。在正反向文庫(kù)中，分別隨機(jī)挑選了190個(gè)克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。根據(jù)斑點(diǎn)雜交信息，在正反向文庫(kù)中共選擇了110個(gè)克隆單