版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程,主要包括:原始卵泡的募集、腔前卵泡的發(fā)育、有腔卵泡的選擇和生長及卵泡的成熟或閉鎖。該過程受激素、生長因子、金屬離子等多種因素控制,最終只有少數(shù)卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并排卵,99%以上的卵泡發(fā)生閉鎖。卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞,它對卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育有至關(guān)重要的作用。伴隨著哺乳動(dòng)物卵泡生長和發(fā)育,顆粒細(xì)胞體積增大、數(shù)量增多并逐步分化和成熟。G蛋白偶聯(lián)受體3(G protein-couple
2、d receptor3,Gpr3)屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。近年來的研究表明,Gpr3在小鼠和人的卵巢中通過Gs蛋白介導(dǎo)的下游通路調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。但Gpr3在豬卵巢中的表達(dá)規(guī)律及在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用目前尚未見報(bào)道。因此,深入研究豬Gpr3在卵巢及卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律,探索Gpr3信號通路在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制,可以為哺乳動(dòng)物繁殖性狀的選育提供可能的理論基礎(chǔ),在提高家畜繁殖性能方面具有重要意義。<
3、br> 本論文以三元商品豬為研究對象,采用電子克隆與傳統(tǒng)克隆相結(jié)合的方法,利用RT-PCR和RACE技術(shù),獲得了豬Gpr3基因的全長序列和舍有完整編碼框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列,并利用生物信息學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究;利用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time) PCR和免疫蛋白印跡(Western blotting)技術(shù)對Gpr3在組織及卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析;利用免疫組織化學(xué)方法對豬胎
4、兒期50、70和90(日齡)、新生1日齡及生后期25、35、70、140和180(日齡)9個(gè)階段豬卵巢組織中Gpr3蛋白的表達(dá)進(jìn)行了細(xì)胞定位;利用real-time PCR和Western blotting技術(shù)對不同日齡、不同品種卵巢及不同直徑卵泡中Gpr3的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析;利用構(gòu)建的Gpr3真核表達(dá)載體及與GFP融合表達(dá)載體檢測了Gpr3在人胚腎(HEK293)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位、組成性活性以及鞘脂類脂質(zhì)對Gpr3組成性活性和受體
5、內(nèi)化作用的影響;采用RNAi技術(shù)敲減Gpr3,阻抑Gpr3介導(dǎo)的信號通路,利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、放射免疫測定(Radioimmunoassay, RIA)、real-time PCR等方法檢測阻抑該信號通路對豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制;采用超表達(dá)Gpr3的方式激活其介導(dǎo)的信號通路,利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、RLA、real-time PCR等方法檢測超表達(dá)Gpr3后對豬卵泡顆粒細(xì)胞生長及分化的影響,主要研究結(jié)果如下:
6、 1用電子克隆和RACE的方法克隆了豬Gpr3基因的全長序列和含有完整編碼框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列,GenBank登錄號分別為HQ606483、HM777010和HM77711,并做生物信息學(xué)預(yù)測分析,結(jié)果表明:豬Gpr3基因的cDNA由2101個(gè)核苷酸組成,編碼330個(gè)氨基酸,分子量為35.2 kDa,位于第6號染色體,與牛、犬、人、黑猩猩、小鼠和大鼠的氨基酸相似性分別為96.4%,95.1%,94.9%,94.8%
7、,90.0%和85.4%。它具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域,存在多個(gè)潛在的磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn),表明它是一個(gè)功能活躍的跨膜蛋白,可能參與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長調(diào)控等過程。另外,豬Gpr3、Gpr6和Gpr12的蛋白序列比對及功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),它們彼此間具有高度的序列同源性和相似的潛在功能,將三者歸為同一受體亞家族,稱為Gpr3亞家族。
2用real-time PCR和Western blotting的方法檢測豬Gpr3基因的組織分
8、布及在卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)模式,結(jié)果表明:豬Gpr3基因在大腦、小腦、下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、胸腺、卵巢、輸卵管、子宮、睪丸、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),但僅在腦、垂體、肝臟、脂肪、子宮和卵母細(xì)胞中大量表達(dá),推測其在豬的神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能維持方面具有重要作用,可能參與豬的脂肪代謝。另外,Gpr3基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)量呈下降趨勢,并且與卵丘擴(kuò)散程度呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.9
9、37,P<0.01),表明其可能對卵丘擴(kuò)散和卵母細(xì)胞成熟具有重要作用。成熟促進(jìn)因子(Maturation promotingfactor,MPF)的調(diào)節(jié)亞基Cyclin B1基因在卵母細(xì)胞體外成熟前期的表達(dá)量較低(0-24h),后期顯著的升高(24-44 h),而催化亞基CDK1基因的表達(dá)水平在整個(gè)培養(yǎng)過程中保持相對穩(wěn)定,說明MPF可能主要在卵母細(xì)胞體外成熟后期發(fā)揮作用。
3用免疫組織化學(xué)方法檢測Gpr3蛋白在9個(gè)階段豬卵
10、巢組織中的表達(dá)與定位,結(jié)果表明:在胎兒和新生期,Gpr3主要在卵母細(xì)胞巢中的卵原細(xì)胞、原始卵泡和初級卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá);在生后期,Gpr3在腔前卵泡和有腔卵泡的顆粒細(xì)胞層、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),并且在卵母細(xì)胞中的表達(dá)量最高。另外,在成年豬卵巢的黃體中也有微弱的表達(dá)。Real-time PCR和Western blotting結(jié)果表明,Gpr3mRNA和蛋白在不同發(fā)育階段豬卵巢中均有表達(dá),表達(dá)量呈波浪狀變化,在新生及出生后140
11、日齡的表達(dá)量最高;在不同品種豬的卵巢中,Gpr3的表達(dá)量趨于一致,未見顯著性差異;在不同直徑豬卵巢卵泡中,Gpr3的表達(dá)量隨著卵泡直徑的增加而上升。豬Gpr3受體在卵巢中的細(xì)胞和時(shí)期特異性表達(dá)模式表明,其可能在豬卵泡發(fā)育和黃體形成過程中發(fā)揮重要作用。
4為了探究Gpr3的性質(zhì)功能并篩選其潛在的配體,我們構(gòu)建了Gpr3真核表達(dá)載體及與GFP融合表達(dá)載體,用以檢測Gpr3在人胚腎(HEK293)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位、組成性活性、
12、鞘脂類脂質(zhì)對組成性活性和受體內(nèi)化的影響。結(jié)果表明:在HEK293細(xì)胞中,Gpr3的表達(dá)引起了腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)組成性激活,并且激活程度與完全激活Gs偶聯(lián)受體的程度相似。而且,鞘氨醇1-磷酸(sphingosine1-phosphate,S1P)可以通過組成性激活的Gpr3受體進(jìn)一步增加AC的活性。當(dāng)在HEK239細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)
13、記的Gpr3受體時(shí)發(fā)現(xiàn),綠色熒光僅集中于細(xì)胞膜和亞細(xì)胞膜中。S1P處理后,通過熒光共聚焦顯微鏡可以觀察到激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體內(nèi)化過程。而鞘氨醇(sphingosine,Sph)和鞘磷脂(sphingomyelin, Sphi)不具備以上功能。說明,Gpr3是組成性激活的G蛋白偶聯(lián)受體,它的組成性活性及激動(dòng)劑誘導(dǎo)的內(nèi)化作用受到脂質(zhì)調(diào)節(jié)者S1P的調(diào)控,表明S1P可能是豬Gpr3受體的潛在激動(dòng)劑。
5為了研究Gpr3信號通路在豬卵泡
14、顆粒細(xì)胞中的作用,本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用RNAi技術(shù)“沉默”Gpr3阻抑其介導(dǎo)的信號通路,以檢測Gpr3受體在豬卵泡顆粒細(xì)胞生長及分化過程中的作用。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染Gpr3特異性的siRNA后,能夠有效地抑制顆粒細(xì)胞中Gpr3 mRNA和蛋白的表達(dá),成功地阻抑了Gpr3介導(dǎo)的信號通路。MTT、流式細(xì)胞術(shù)及RLA檢測的結(jié)果表明,阻抑Gpr3信號通路能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,抑制顆粒細(xì)胞凋亡,
15、但對顆粒細(xì)胞中類固醇激素的合成沒有影響。另外,阻抑Gpr3信號通路顯著改變了Cyclin B1、CyclinD2、Bcl-2、Bax和Gpr12的表達(dá)(P<0.05),而對CDK1、CDK、P450arom、P450scc和Gpr6的表達(dá)沒有影響(P>0.05)。
6為了進(jìn)一步明確Gpr3在豬顆粒細(xì)胞中的功能,我們在顆粒細(xì)胞中超表達(dá)了Gpr3受體,結(jié)果表明:超表達(dá)Gpr3能顯著抑制顆粒細(xì)胞的增殖,增加G0/G1期細(xì)胞的百分
16、含量,減少S期的細(xì)胞,同時(shí)降低細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白Cyclin B1和CDK1的mRNA表達(dá);超表達(dá)Gpr3能顯著增加顆粒細(xì)胞的凋亡比率,抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax的表達(dá);超表達(dá)Gpr3促進(jìn)了Gpr6的表達(dá);然而,超表達(dá)Gpr3不影響雌二醇和孕酮的分泌,并且未顯著改變P450arom和P450scc的表達(dá)。由此可見,Gpr3信號通路在調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞生長和凋亡過程中具有重要的作用,相關(guān)基因表達(dá)量的改變?yōu)檫M(jìn)一步探索Gpr3受體在調(diào)節(jié)卵
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- BMP-Smad信號通路對豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響.pdf
- 鉛鎘對小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及凋亡基因表達(dá)的影響.pdf
- 豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及幾種影響因素的研究.pdf
- 水牛卵泡顆粒細(xì)胞自噬及其調(diào)控對細(xì)胞增殖的影響研究
- RNAi抑制Smad4基因表達(dá)對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響.pdf
- miR--26b調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制.pdf
- Bcl-2和Inhibinα基因?qū)Z卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響.pdf
- 水牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征.pdf
- 沉默BMPR-IB基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及BMP通路相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf
- AQP9基因在水牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf
- FSH調(diào)控小鼠卵泡閉鎖及卵泡顆粒細(xì)胞Cyp1b1基因表達(dá)機(jī)制.pdf
- 顆粒細(xì)胞過表達(dá)FSHR對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響研究.pdf
- 一氧化氮對豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵母細(xì)胞成熟的影響.pdf
- 卵泡抑素對牛顆粒細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究.pdf
- 815.mir381在小鼠卵泡不同發(fā)育階段的表達(dá)及其對顆粒細(xì)胞的影響
- 生殖激素對體外培養(yǎng)的水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響研究.pdf
- ADAM基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá).pdf
- 抑制素對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf
- MiRNA-130a在小鼠卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)和對顆粒細(xì)胞的影響.pdf
- 熱應(yīng)激對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞功能及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf
評論
0/150
提交評論