BMP-Smad信號通路對豬卵泡顆粒細胞的影響.pdf

1、繁殖力是影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的最重要因素之一，是決定養(yǎng)豬業(yè)效益高低的主要限制因素。繁殖力的高低取決于母體卵巢卵泡的生長發(fā)育，因為卵泡發(fā)育決定了排卵數(shù)，是影響繁殖力的關鍵因素。掌握母豬卵泡發(fā)育規(guī)律及其影響因素有利于進一步提高母豬繁殖能力，提高豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。哺乳動物卵泡發(fā)育是十分復雜的過程，主要包括：原始卵泡的募集、腔前卵泡的發(fā)育、有腔卵泡的選擇和生長及卵泡的成熟或閉鎖。隨著后基因組信息學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)卵泡的生長發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)的、非獨立

2、生理生化過程，受多種相同或者不同的細胞內(nèi)、外因子及信號通路的影響和控制。
　　 卵泡顆粒細胞是卵泡中最重要的體細胞，它對卵母細胞成熟、卵泡發(fā)育有至關重要的作用。伴隨著哺乳動物卵泡生長和發(fā)育，顆粒細胞體積增大、數(shù)量增多及逐步分化和成熟。BMPs(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于TGF-β超家族成員，近幾年，研究人員對BMPs在繁殖上的作用進行了廣泛的研究，包括卵泡的生長發(fā)育、顆粒細胞和膜細胞的

3、增殖與凋亡、類固醇激素的合成、卵母細胞成熟、排卵和黃體化等。但BMP/Smad信號通路在豬卵泡顆粒細胞中具體作用及機制目前尚未見報道。因此，深入研究BMP/Smad信號通路在卵泡發(fā)育過程顆粒細胞中的作用及其調(diào)控機制，可以為哺乳動物繁殖性狀的選育提供可能的理論基礎，在提高家畜繁殖性能方面有重要意義。
　　 本研究以豬卵泡顆粒細胞(GCs)為實驗材料，采用real time RT-PCR方法檢測BMP/Smad信號通路中關鍵因子(受

4、體和下游信號分子)在豬卵泡不同發(fā)育時期的顆粒細胞中的表達水平；利用免疫組織化學方法就BMP/Smad信號通路核心下游信號分子-Smad4，在豬卵巢中的細胞定位進行研究；用RNAi方法敲減Smad4，以阻抑BMP/Smad信號通路，利用MTT、流式細胞術、CLIA，real time RT-PCR等方法檢測阻抑該信號通路對豬卵泡顆粒細胞的作用及其分子機制；在阻抑通路的基礎上，額外添加FSH，利用MTT、流式細胞術、CLIA、real ti

5、me RT-PCR等方法檢測阻抑該信號通路對FSH影響豬卵泡顆粒細胞的作用的影響；用BMP配體(BMP-6)激活BMP/Smad信號通路，用RNAi方法敲減Smad4，以阻抑該通路，分別利用MTT、流式細胞術、CLIA等方法檢測兩種條件下體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞的存活率、細胞周期、類固醇激素分泌水平等，并采用高通量基因芯片技術，對阻抑信號通路和阻抑后激活信號通路的豬卵泡顆粒細胞之間的差異表達基因進行比較研究，
　　 主要研究結(jié)果

6、如下：
　　 1用real time RT-PCR法檢測不同發(fā)育時期豬卵泡顆粒細胞中BMP/Smad信號通路的關鍵因子(BMP受體和Smads)表達情況，結(jié)果表明：BMP受體和Smads在豬卵泡顆粒細胞中均有表達，并且ActR1A和BMPR2 mRNA在大卵泡顆粒細胞中的表達量顯著高于小卵泡(P<0.05)。BMPR1A、ActR2、Smad1、Smad5和Smad8在卵泡發(fā)育過程中的表達有增加趨勢，但差異不顯著。相反，BMPR

7、1B、Smad4和Smad7的表達有一定程度的下降。這表明BMP/Smad信號通路關鍵因子在豬卵泡發(fā)育階段特異性表達，在卵泡顆粒細胞生長與分化過程中起重要的調(diào)控作用。
　　 2用免疫組織化學方法檢測Smad4在豬卵巢組織中的定位與表達，結(jié)果顯示，Smad4在豬卵泡的多個發(fā)育階段的細胞中均有表達。在原始卵泡中和初級卵泡中，Smad4在卵母細胞的細胞質(zhì)中表達，而在顆粒細胞中沒有表達；在腔前卵泡中，Smad4蛋白在卵母細胞和顆粒細胞中

8、均有表達，在有腔卵泡中，Smad4蛋白主要被定位到顆粒細胞和卵泡內(nèi)膜細胞中，而卵母細胞中表達較弱。
　　 3為了研究BMP/Smad信號通路在豬卵泡顆粒細胞中的作用，本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細胞(pGCs)進行體外培養(yǎng)?；赟mad4在該通路中的核心地位，采用RNAi技術“沉默”豬Smad4基因，阻抑BMP/Smad信號通路，以檢測阻抑該通路對豬卵泡顆粒細胞生長和類固醇激素分泌的影響。結(jié)果表明：采用的RNAi技

9、術成功的“敲減”豬Smad4基因，在mRNA水平該基因被下調(diào)89％，蛋白水平被下調(diào)56.6％。建立了BMP/Smad信號通路阻抑的細胞模型。阻抑該通路能顯著抑制細胞的增殖，增加G1期細胞的百分含量，減少S期的細胞，并能顯著下調(diào)細胞增殖標志因子Cyclin D2和CDK4的mRNA表達。阻抑該通路能顯著增加顆粒細胞的凋亡比率，下調(diào)Bcl-2的表達，但不影響B(tài)ax的表達。阻抑該通路能顯著抑制雌二醇的分泌，并下調(diào)P450arom mRNA的表

10、達，表明BMP/Smad信號通路在豬卵泡顆粒細胞中有重要的調(diào)控作用。
　　 4為研究BMP/Smad信號通路對FSH誘導豬卵泡顆粒細胞的影響，本研究在阻抑BMP/Smad信號通路的細胞中添加FSH。用MTT法檢測細胞增殖情況、流式細胞法檢測細胞周期變化、CLIA方法檢測雌二醇和孕酮的分泌以及real time RT-PCR檢測相關基因的mRNA表達。結(jié)果表明：阻抑信號通路下調(diào)FSH受體的表達，阻抑信號通路使FSH促進細胞增殖的作

11、用減弱，阻抑信號通路能顯著增加G1期的細胞比率，即使添加FSH；阻抑通路能降低Cyclin D2的表達，且能抑制FSH促進其表達；阻抑信號通路能抑制CDK4的表達，即使添加FSH；阻抑信號通路能降低FSH誘導細胞分泌雌二醇的能力，但對孕酮沒有影響。阻抑信號通路能減少P450arom的表達，并且降低FSH對其表達的影響；阻抑信號通路抑制FSH對P450scc表達的影響。
　　 5為研究BMP/Smad信號通路對豬卵泡顆粒細胞的影響

12、，基于Smad4在該通路中的核心地位，采用RNAi技術“沉默”豬Smad4基因，阻抑BMP/Smad信號通路，另一方面，添加BMP配體(BMP-6)激活該通路，分別觀察阻抑和/或激活BMP/Smad信號通路對細胞生物學特性的影響。結(jié)果表明：阻抑通路顯著抑制細胞的增殖，增加G1期的細胞，減少S期細胞；激活通路則促進細胞生長，減少G1期細胞，增加S期細胞，阻抑信號通路能抑制雌二醇的合成，對孕酮沒有顯著影響，激活該通路抑制兩種類固醇激素的分泌