補(bǔ)腎法、疏肝法對IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞GDF-9及其Smads信號通路的影響.pdf

1、目的:觀察補(bǔ)腎法、疏肝法對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者妊娠結(jié)局的影響;研究兩法改善妊娠結(jié)局，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用與GDF-9分泌因子及其Smads信號通路的關(guān)系，比較兩法作用機(jī)制的異同，為補(bǔ)腎法、疏肝法治療排卵障礙性疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:2011年7月至2012年9月于白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET的符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的60例不孕癥患者，所有受試患者需經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，

2、簽署知情同意書。其中符合中醫(yī)腎虛證標(biāo)準(zhǔn)的女性患者20例為補(bǔ)腎組，符合中醫(yī)肝郁證標(biāo)準(zhǔn)的女性患者20例為疏肝組，設(shè)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的20例患者為對照組。補(bǔ)腎組為中藥補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方+西藥控制性超排卵組，疏肝組為逍遙散+西藥控制性超排卵組，對照組為單純性控制性超排卵組。觀察注射HCG日血清中E2、P、LH水平、獲卵個(gè)數(shù)、受精數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。留取兩側(cè)卵巢所有直徑≥18mm的優(yōu)勢卵泡的卵泡液，用人淋巴細(xì)胞分離液分離出顆粒細(xì)胞。另將采集于白求恩國際和平醫(yī)院婦

3、產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心和石家莊市四院生殖醫(yī)學(xué)中心的因輸卵管因素行IVF-ET的正?；颊叩暮蓄w粒細(xì)胞的卵泡液用人淋巴細(xì)胞分離液分離出顆粒細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，24h后細(xì)胞貼壁，分別加入補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散的高濃度(18％)、中濃度(12％)、低濃度(6％)人含藥血清處理細(xì)胞6h、12h、24h、48h，分別為補(bǔ)腎高、中、低劑量組和疏肝高、中、低劑量組。加正常人血清的標(biāo)本為0h即空白對照。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方

4、法檢測顆粒細(xì)胞中GDF-9、BMPR-Ⅱ、Alk5、Smad2/3/4mRNA的表達(dá);采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測顆粒細(xì)胞中GDF-9、BMPR-Ⅱ、Alk5、Smad2/3/4蛋白的表達(dá);用Incell-westem方法檢測培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中GDF-9、BMPR-Ⅱ、Alk5、Smad2/3/4蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、補(bǔ)腎法、疏肝法對IVF-ET患者治療結(jié)果的影響
　　 1.1、HCG日各組患者血清中E

5、2、P、LH水平
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組血清E2水平均增高（均P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組血清E2水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。與對照組相比較，補(bǔ)腎組、疏肝組血清LH、P無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 1.2、各組患者獲卵個(gè)數(shù)、受精數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組獲卵個(gè)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），受精數(shù)明顯增多（均P＜0.05）。與疏

6、肝組比較，補(bǔ)腎組受精數(shù)有增多趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對照組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組的優(yōu)質(zhì)胚胎個(gè)數(shù)明顯增多（均P＜0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組優(yōu)質(zhì)胚胎個(gè)數(shù)略減少，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2、補(bǔ)腎法、疏肝法對IVF-ET患者顆粒細(xì)胞GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)的影響
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞中GDF-9mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（

7、均P＜0.05）。與疏肝組相比較，補(bǔ)腎組顆粒細(xì)胞GDF-9mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞BMPR-ⅡmRNA表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞ALK5mRNA表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad2mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（均P＜0.

8、05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組顆粒細(xì)胞Smad2mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad3mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組顆粒細(xì)胞Smad3mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad4mRNA表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、補(bǔ)腎法、疏肝法對I

9、VF-ET患者顆粒細(xì)胞GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)的影響
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞GDF-9蛋白表達(dá)增強(qiáng)（均P＜0.05)。與疏肝組相比較，補(bǔ)腎組GDF-9蛋白表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組的BMPR-Ⅱ蛋白表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　 各組顆粒細(xì)胞中ALK5蛋白未見表達(dá)

10、。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad2蛋白表達(dá)增強(qiáng)(均P＜0.05)。與疏肝組相比較，補(bǔ)腎組顆粒細(xì)胞Smad2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad3蛋白表達(dá)增強(qiáng)（均P＜0.05）。與疏肝組相比較，補(bǔ)腎組顆粒細(xì)胞Smad3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與對照組比較，補(bǔ)腎組和疏肝組顆粒細(xì)胞Smad4蛋白表達(dá)有增

11、強(qiáng)趨勢，但無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4、補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散含藥血清對體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)的影響
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏肝高、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h GDF-9蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05)。6h GDF-9蛋白表達(dá)明顯高于12h、24h、48h(P＜0.05)。與補(bǔ)腎高

12、、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞6h比較，疏肝高、中、低劑量GDF-9蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。與6h補(bǔ)腎高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，補(bǔ)腎中、低劑量GDF-9蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。與6h疏肝高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，疏肝中、低劑量GDF-9蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）。
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏肝高、中、低劑量中藥孵育的顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h BMPR-Ⅱ蛋白表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，無統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義（P＞0.05）。與補(bǔ)腎高、中、低劑量比較，疏肝高、中、低劑量BMPR-Ⅱ蛋白表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏肝高、中、低劑量中藥孵育的顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h ALK5蛋白表達(dá)下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與補(bǔ)腎高、中、低劑量比較，疏肝高、中、低劑量ALK5蛋白表達(dá)下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏

14、肝高、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h Smad2蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05)。48h Smad2蛋白表達(dá)明顯高于6h、12h、24h(P＜0.05)。與補(bǔ)腎高、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞48h比較，疏肝高、中、低劑量Smad2蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。與48h補(bǔ)腎高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，補(bǔ)腎中、低劑量Smad2蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。與48h疏肝高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，疏肝中、低劑量Sma

15、d2蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏肝高、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h Smad3蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05)。48h Smad3蛋白表達(dá)明顯高于6h、12h、24h(P＜0.05)。與補(bǔ)腎高、中、低劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞48h比較，疏肝高、中、低劑量蛋白Smad3表達(dá)均下降(P＜0.05)。與48h補(bǔ)腎高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，補(bǔ)腎中、低劑量Smad3蛋白表

16、達(dá)均下降(P＜0.05)。與48h疏肝高劑量中藥孵育顆粒細(xì)胞比較，疏肝中、低劑量Smad3蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）。
　　 與0h比較，補(bǔ)腎高、中、低劑量，疏肝高、中、低劑量中藥孵育的顆粒細(xì)胞6h、12h、24h、48h Smad4蛋白表達(dá)有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與補(bǔ)腎高、中、低劑量比較，疏肝高、中、低劑量Smad4蛋白表達(dá)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.在服用

17、西藥同時(shí)加用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散均不會(huì)降低獲卵數(shù)，并能增加優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞數(shù)量，提高妊娠率及總胚胎數(shù)。
　　 2.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用與上調(diào)顆粒細(xì)胞中GDF-9及其Smads通路中Smad2、Smad3 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)，并呈現(xiàn)出量效關(guān)系，兩方均以高劑量效果更強(qiáng)。
　　 3.卵巢顆粒細(xì)胞與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散孵育6h時(shí)GDF-9蛋白的表達(dá)達(dá)高峰，孵育48h時(shí)Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)達(dá)高峰，而補(bǔ)