補腎法、疏肝法調(diào)控小鼠體外發(fā)育腔前卵泡卵母細胞BMP15-BMP6-Smads-sohlh2信號通路的比較研究.pdf

1、卵巢具有生殖和內(nèi)分泌功能，其功能失調(diào)是造成女性生殖能力降低的重要原因。在社會和醫(yī)源性因素的綜合作用下我國女性不孕癥發(fā)病率逐年上升，目前已達10％~15%，嚴重影響了女性的身體健康和家庭幸福。以體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技術(shù)為代表的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）是目前解決不孕問題的重要手段之一，然

2、而優(yōu)質(zhì)卵母細胞的缺乏導(dǎo)致IVF-ET技術(shù)仍難以擺脫高流產(chǎn)率，低妊娠率的困境。在哺乳動物（包括人）的卵巢內(nèi)，腔前卵泡是卵泡儲備庫的基本組成單位，維系著雌性哺乳動物和女性的生殖壽命。雖然其數(shù)量眾多，但是隨著個體發(fā)育，99%以上的腔前卵泡發(fā)生閉鎖退化，只有極少數(shù)能發(fā)育成熟并排出，無疑造成了生殖資源的巨大浪費。因此，了解腔前卵泡的生長發(fā)育機制，以充分開發(fā)和利用這一資源具有廣泛而深遠的醫(yī)學(xué)價值。
　　卵母細胞質(zhì)量受多種因素影響，隨著分子生物

3、學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)機理的認識不斷深化，卵巢局部多因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)尤其是卵母細胞分泌因子（oocyte-secreted factors，OSFs）的提出對傳統(tǒng)的下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控卵泡發(fā)育的理論形成了巨大挑戰(zhàn)，成為生殖醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的焦點。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ bone morphogenetic protein，BMP）15和BMP6是重要的OSFs，在卵泡生長、優(yōu)勢卵泡選擇、卵丘擴張、排卵、黃體形成、卵泡

4、閉鎖等諸多方面發(fā)揮了重要作用。二者生物學(xué)功能的發(fā)揮主要通過 Smads（ drosophila mothers against decapentaplegic proteins）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)，即首先與Ⅱ型受體結(jié)合，然后募集Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體作用于細胞內(nèi)受體調(diào)節(jié)型 Smads（receptor-regulated Smads，R-Smads）并將其磷酸化，在共同介導(dǎo)型Smad（common-mediator Smad，Co-Sm

5、ad）的協(xié)同下轉(zhuǎn)移至細胞核調(diào)控相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄。
　　近年來，中醫(yī)藥在促進卵泡發(fā)育，提高卵母細胞質(zhì)量方面的作用日益突出。本課題組前期在補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散對IVF-ET患者顆粒細胞和卵泡液中OSFs以及妊娠結(jié)局影響的比較研究中發(fā)現(xiàn)，補腎法、疏肝法均可以增加IVF-ET患者獲卵數(shù)，提高優(yōu)胚率，改善妊娠率，但兩法的作用途徑不盡相同，補腎法通過上調(diào)顆粒細胞中 BMP15和 BMP6、卵泡液中BMP6表達來發(fā)揮作用，而疏肝法通過上調(diào)顆粒細胞中

6、BMP15表達來發(fā)揮功能；并進一步以O(shè)SFs及其Smads信號通路為切入點對補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散（丸）提高IVF-ET患者和控制性超排卵小鼠卵母細胞質(zhì)量的機制進行了研究，證實補腎法、疏肝法提高卵母細胞質(zhì)量作用的發(fā)揮與調(diào)控IVF-ET患者顆粒細胞和超排卵小鼠卵母細胞中BMP15/BMP6-Smads信號通路有一定的關(guān)系，且具體作用環(huán)節(jié)不盡相同。然而并未對卵泡發(fā)育過程中的卵母細胞以及相關(guān)信號通路的下游靶基因進行更為深入的探討。原代細胞培養(yǎng)可以

7、最大程度地保持細胞的初始特性，離體腔前卵泡體外培養(yǎng)體系是研究中藥作用機制的良好載體，本研究以補腎調(diào)經(jīng)方作為補腎法的代表方，逍遙丸作為疏肝法的代表方，在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步觀察補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸含藥血清對體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡卵母細胞 BMP15/BMP6-Smads-精卵發(fā)生特異性的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子2（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix

8、transcription factor2， sohlh2）信號通路中的主要效應(yīng)分子的影響，以探究BMP15/BMP6-Smads信號通路的可能下游靶基因，闡釋兩法提高體外發(fā)育腔前卵泡卵母細胞質(zhì)量的可能分子生物學(xué)機制，比較兩法具體作用位點有何異同，從而完善中醫(yī)生殖理論，并為優(yōu)化卵泡體外培養(yǎng)體系以及ART發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡成活率及卵泡直徑影響的比較
　　目的：觀察補腎調(diào)經(jīng)方、逍

9、遙丸含藥血清對體外培養(yǎng)第6天（the sixth day，D6）小鼠腔前卵泡成活率和卵泡直徑的影響，探討兩方對腔前卵泡體外發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　大鼠含藥血清制備：28只6周齡健康雌性SD大鼠隨機數(shù)字表法隨機分為7組：補腎低劑量組、補腎中劑量組、補腎高劑量組、疏肝低劑量組、疏肝中劑量組、疏肝高劑量組和空白對照組，每組4只。分別灌服1.54g/ml、3.08g/ml、4.62g/ml補腎調(diào)經(jīng)方濃縮口服液，0.09g/

10、ml、0.18g/ml、0.27g/ml逍遙丸混懸液和蒸餾水，每日兩次，1ml/（100g·d），連續(xù)3日。第4日禁食12h后一次性灌服全天劑量，1h后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，股動脈取血。37℃水浴15min，常溫下3000轉(zhuǎn)/分鐘（revolution per minute， rpm）離心15min，取上清，56℃水浴30min，同組血清混勻，過濾除菌、分裝，得補腎調(diào)經(jīng)方低、中、高劑量大鼠含藥血清，逍遙丸低、中、高劑量大鼠含藥血清

11、以及正常大鼠血清。
　　腔前卵泡分離：采用機械顯微分離法。24只12日齡昆明小鼠分批頸椎脫臼法處死，無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，用含青霉素200IU/ml、鏈霉素200μg/ml的生理鹽水清洗2~3次后置于工作液中，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，40倍體視顯微鏡下用25G的針頭劃開卵巢，分離卵泡，注意保持卵泡基底膜的完整性。
　　腔前卵泡分組培養(yǎng)：采用改良的普通培養(yǎng)法群體培養(yǎng)。選擇形態(tài)規(guī)則完整，直徑在80~120μm之間的腔前卵泡移入裝

12、有培養(yǎng)液的35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中預(yù)先平衡過夜，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱。卵泡貼壁后分別以10%正常大鼠血清、10%補腎調(diào)經(jīng)方大鼠含藥血清和10%逍遙丸大鼠含藥血清孵育，分為正常組、補腎組、疏肝組，不加大鼠血清為空白組，其中補腎組和疏肝組分別設(shè)置低、中、高三個劑量組。體外培養(yǎng)6天。每日倒置顯微鏡下觀察卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，D6計數(shù)存活卵泡數(shù)量，測量卵泡直徑。
　　結(jié)果：
　　1各組卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)變

13、化
　　D2各組卵泡固定在培養(yǎng)皿底，不能移動，卵母細胞清晰可見；D4卵泡增大，顆粒細胞數(shù)目明顯增多，培養(yǎng)皿底平鋪一層細胞；D6顆粒細胞層數(shù)增多，越過基底膜生長，難以清晰觀察到卵母細胞，卵泡呈“煎蛋樣”生長。
　　2各組卵泡成活率比較
　　空白組、正常組、補腎低中劑量組、疏肝低中劑量組之間卵泡成活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎高劑量組、疏肝高劑量組升高（P＜0.05），且補腎高劑量組高于疏肝高劑量組（P＜0.05）

14、。
　　3各組卵泡直徑比較
　　空白組與正常組卵泡直徑無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），各用藥組增大（P＜0.05）。補腎組組內(nèi)比較，補腎高劑量組最大，補腎中劑量組次之，補腎低劑量組最?。≒＜0.05），呈劑量依賴性；疏肝組組內(nèi)比較，疏肝高劑量組大于疏肝中低劑量組（P＜0.05），疏肝中低劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎高劑量組大于疏肝高中低劑量組（P＜0.05），補腎中劑量組大于疏肝中低劑量

15、組（P＜0.05），補腎低劑量組與疏肝低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　小結(jié)：補腎法、疏肝法均可以提高體外培養(yǎng)腔前卵泡成活率，增大卵泡直徑，促進體外卵泡發(fā)育，且補腎法優(yōu)于疏肝法。
　　第二部分補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)過程中小鼠腔前卵泡卵母細胞BMP15、BMP6影響的比較
　　目的：觀察補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸含藥血清對體外培養(yǎng)過程中小鼠腔前卵泡卵母細胞 BMP15、BMP6的影響，探討兩方提高體外培養(yǎng)卵泡卵母細胞

16、質(zhì)量與調(diào)控BMP15、BMP6表達的關(guān)系。
　　方法：腔前卵泡分離、分組培養(yǎng)同第一部分。卵母細胞收集：采用酶消化法。分別于 D2、D4、D6體視顯微鏡下使卵泡懸浮，離心后依次用0.25%膠原酶NB4和0.1%透明質(zhì)酸酶37℃消化腔前卵泡5~10min，消化過程中間斷性輕輕吹打，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）反復(fù)漂洗后得到卵母細胞。分別用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymeras-e cha

17、in reaction，PCR）檢測 BMP15、BMP6信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），細胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）和流式液相多重蛋白定量技術(shù)（cytometric bead array，CBA）檢測BMP15、BMP6蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1體外培養(yǎng)D2各組卵母細胞BMP15、BMP6 mRNA和蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常

18、組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），各用藥組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均升高（P＜0.05）。補腎組和疏肝組各自組內(nèi)比較，BMP15 mRNA和蛋白、BMP6 mRNA均以高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05），BMP6蛋白補腎組呈劑量依賴性（P＜0.05），疏肝組中疏肝高劑量組高于疏肝中低劑量組（P＜0.05），疏肝中低劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎

19、高劑量組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05）；補腎中劑量組BMP15 mRNA、BMP6 mRNA和蛋白均高于疏肝中低劑量組（P＜0.05），補腎中劑量組BMP15蛋白與疏肝中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于疏肝低劑量組（P＜0.05）；補腎低劑量組 BMP15 mRNA高于疏肝低劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組與疏肝低劑量組BMP15蛋白、BMP6 mRNA和蛋白無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.

20、05）。
　　2體外培養(yǎng)D4各組卵母細胞BMP15、BMP6 mRNA和蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），各用藥組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均升高（P＜0.05）。補腎組組內(nèi)比較，BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均以補腎高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）；疏肝組組內(nèi)比較，BMP15 mRNA和蛋白疏肝高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜

21、0.05），BMP6 mRNA和蛋白疏肝高劑量組高于疏肝中低劑量組（P＜0.05），疏肝中低劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎高劑量組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05）；補腎中劑量組 BMP15 mRNA和蛋白與疏肝中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于疏肝低劑量組（P＜0.05），補腎中劑量組BMP6 mRNA和蛋白高于疏肝中低劑量組（P＜0.05）；補

22、腎低劑量組 BMP15 mRNA高于疏肝低劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組BMP15蛋白、BMP6 mRNA和蛋白與疏肝低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3體外培養(yǎng)D6各組卵母細胞BMP15、BMP6 mRNA和蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），各用藥組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均升高（P＜0.05）。補腎組組內(nèi)比較，BMP15、

23、BMP6 mRNA和蛋白均以補腎高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）；疏肝組組內(nèi)比較，疏肝高劑量組BMP15 mRNA和蛋白與疏肝中劑量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于疏肝低劑量組（P＜0.05），BMP6 mRNA和蛋白疏肝高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎高劑量組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05）；補腎中劑量組BMP15、BMP6 mRNA和蛋白均

24、高于疏肝中低劑量組（P＜0.05）；補腎低劑量組BMP15 mRNA和蛋白與疏肝低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎低劑量組BMP6 mRNA和蛋白高于疏肝低劑量組（P＜0.05）。
　　4各組卵母細胞不同時間點BMP15、BMP6 mRNA和蛋白表達的比較
　　BMP15 mRNA和蛋白，空白組和正常組D2、D4、D6有逐漸升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），補腎低中劑量組和疏肝低中劑量組D4與D2無統(tǒng)計學(xué)差異

25、（P＞0.05），D6較D4、D2升高（P＜0.05），補腎高劑量組D4較D2升高（P＜0.05），D6較D4升高（P＜0.05），疏肝高劑量組D4較D2升高（P＜0.05），D6與D4無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；BMP6 mRNA和蛋白，空白組和正常組D2、D4、D6有逐漸升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），補腎組D4較D2升高（P＜0.05），D6較D4升高（P＜0.05），疏肝組中疏肝低中劑量組D4與D2無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞

26、0.05），D6較D4、D2升高（P＜0.05），疏肝高劑量組D4較D2升高（P＜0.05），D6與D4無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　小結(jié)：補腎法、疏肝法可能通過上調(diào)體外培養(yǎng)過程中腔前卵泡卵母細胞 BMP15、BMP6基因和蛋白表達水平發(fā)揮提高卵母細胞質(zhì)量的作用，隨培養(yǎng)時間延長兩法作用更為明顯，且補腎法優(yōu)于疏肝法。
　　第三部分補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡卵母細胞 BMP15、BMP6膜受體及Smads信號分子

27、影響的比較
　　目的：觀察補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸含藥血清對體外培養(yǎng)D6小鼠腔前卵泡卵母細胞中激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALK）2、ALK6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ（bone morphogenetic protein receptor， BMPRⅡ）、Smad1、Smad5、Smad8、p-Smad1/5/8的影響，分析兩方提高體外卵母細胞質(zhì)量的可能機制。
　　方法：腔前卵泡分離、

28、培養(yǎng)方法同第一部分。
　　實驗分組：選取合適的腔前卵泡隨機分為空白組、正常組、補腎組、疏肝組、抑制劑組，空白組不加大鼠血清，其余各組分別加入10%正常大鼠血清、10%補腎調(diào)經(jīng)方大鼠含藥血清、10%逍遙丸大鼠含藥血清、10%高劑量大鼠含藥血清+10μmol/L K02288，其中補腎組和疏肝組分別設(shè)置低、中、高三個劑量組，抑制劑組設(shè)置補腎抑制劑組和疏肝抑制劑組。
　　卵母細胞收集：抑制劑組在細胞收集前以K02288孵育2h，之

29、后操作與其它組相同，具體流程同第二部分。實時熒光定量 PCR檢測 ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5、Smad8 mRNA，細胞免疫熒光檢測上述指標和p-Smad1/5/8蛋白表達，流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1各組卵母細胞ALK2、ALK6 mRNA和蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常組ALK2、ALK6 mRNA

30、和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎組和疏肝組ALK2、ALK6 mRNA和蛋白均升高（P＜0.05）。補腎組和疏肝組各自組內(nèi)比較，ALK2、ALK6 mRNA和蛋白均以高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎高劑量組ALK2、ALK6 mRNA和蛋白均高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05）；補腎中劑量組ALK2、ALK6 mRNA和蛋白均高于疏肝中低劑量組（P＜0.05）；補腎低劑量組ALK2 mR

31、NA和蛋白高于疏肝低劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組ALK6 mRNA和蛋白與疏肝低劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2各組卵母細胞BMPRⅡmRNA和蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常組 BMPRⅡ mRNA和蛋白無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎組和疏肝組BMPRⅡmRNA和蛋白升高（P＜0.05）。補腎組和疏肝組各自組內(nèi)比較，BMPRⅡ mRNA和蛋白均以高劑量組最高，呈劑量依賴性（ P＜0.05）。補腎

32、組和疏肝組組間比較，疏肝高劑量組BMPRⅡmRNA和蛋白高于補腎高中低劑量組（P＜0.05）；疏肝中劑量組高于補腎中低劑量組（P＜0.05）；疏肝低劑量組高于補腎低劑量組（P＜0.05）。
　　3各組卵母細胞Smad1、Smad5、Smad8 mRNA和蛋白表達比較
　　Smad1 mRNA和蛋白：空白組、正常組、補腎低劑量組、疏肝低中劑量組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎中高劑量組、疏肝高劑量組升高，其中補腎高劑量

33、組與疏肝高劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于補腎中劑量組（P＜0.05）。
　　Smad5、Smad8 mRNA和蛋白：與空白組比較，正常組Smad5、Smad8 mRNA和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎組和疏肝組Smad5、Smad8 mRNA和蛋白均升高（P＜0.05）。補腎組組內(nèi)比較，Smad5 mRNA和蛋白補腎高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05），Smad8 mRNA和蛋白補腎高劑量組與補腎中劑量組

34、無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于補腎低劑量組（P＜0.05）；疏肝組組內(nèi)比較，Smad5 mRNA和蛋白疏肝高劑量組與疏肝中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于疏肝低劑量組（P＜0.05）， Smad8 mRNA和蛋白疏肝高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，Smad5 mRNA和蛋白疏肝高劑量組與補腎高劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），高于補腎中低劑量組（P＜0.05），疏肝中劑量組高于補腎中低劑

35、量組（P＜0.05），疏肝低劑量組高于補腎低劑量組（P＜0.05）；Smad8 mRNA和蛋白補腎高劑量組高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05），補腎中劑量組高于疏肝中低劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組高于疏肝低劑量組（P＜0.05）。
　　4各組卵母細胞p-Smad1/5/8蛋白表達比較
　　與空白組比較，正常組p-Smad1/5/8蛋白無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），補腎組和疏肝組升高（ P＜0.05）。補腎組和疏肝組各

36、自組內(nèi)比較， p-Smad1/5/8蛋白均以高劑量組最高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。補腎組和疏肝組組間比較，補腎高劑量組p-Smad1/5/8蛋白高于疏肝高中低劑量組（P＜0.05），補腎中劑量組高于疏肝中低劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組高于疏肝低劑量組（P＜0.05）。分別與補腎高劑量組、疏肝高劑量組比較，補腎抑制劑組、疏肝抑制劑組 p-Smad1/5/8蛋白均降低（P＜0.05）。
　　小結(jié)：補腎法、疏肝法可能通過增

37、加ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5、Smad8基因和蛋白表達、p-Smad1/5/8蛋白表達，上調(diào)Ⅰ型受體的磷酸化作用，增強BMP15/BMP6-Smads信號傳導(dǎo)，從而提高體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡卵母細胞質(zhì)量。并且在上調(diào)Ⅰ型受體、Smad1、Smad8和p-Smad1/5/8方面補腎法優(yōu)于疏肝法，上調(diào)Ⅱ型受體和Smad5方面疏肝法優(yōu)于補腎法。
　　第四部分補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡卵母細胞sohlh2

38、影響的比較
　　目的：觀察補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸含藥血清對體外培養(yǎng)D6小鼠腔前卵泡卵母細胞sohlh2的影響，探究兩方提高卵母細胞質(zhì)量機制的可能靶點。
　　方法：腔前卵泡分離、培養(yǎng)方法同第一部分，實驗分組、卵母細胞收集同第三部分。實時熒光定量PCR檢測sohlh2 mRNA，細胞免疫熒光檢測sohlh2蛋白表達。
　　結(jié)果：空白組、正常組、補腎低劑量組、疏肝中低劑量組sohlh2 mRNA和蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05

39、），補腎中高劑量組、疏肝高劑量組升高（P＜0.05），由高到低依次為補腎高劑量組、補腎中劑量組、疏肝高劑量組（P＜0.05）。分別與補腎高劑量組、疏肝高劑量組比較，補腎抑制劑組、疏肝抑制劑組sohlh2 mRNA和蛋白均降低（P＜0.05）。
　　小結(jié)：sohlh2可能是補腎法、疏肝法調(diào)控BMP15/BMP6-Smads信號傳導(dǎo)的靶基因，且補腎法上調(diào)sohlh2表達的作用優(yōu)于疏肝法。
　　結(jié)論：補腎法、疏肝法可能通過調(diào)控體外

40、發(fā)育腔前卵泡卵母細胞中BMP15/BMP6-Smads-sohlh2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進體外卵泡發(fā)育，提高卵母細胞質(zhì)量，具體機制是：誘導(dǎo)BMP15和BMP6與Ⅱ型受體BMPRⅡ結(jié)合，分別募集 BMP15的Ⅰ型受體 ALK6、BMP6的Ⅰ型受體 ALK2和ALK6，增強Ⅰ型受體的磷酸化作用，進而將受體后信號分子 Smad1、Smad5、Smad8磷酸化為 p-Smad1/5/8，作用于下游靶基因 sohlh2，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在上調(diào)BMP1